吸煙誘導水解酶活性微囊泡在粥樣斑塊薄壁纖維帽進展中的研究.pdf

1、目的:
　　 吸煙明顯增加動脈粥樣硬化（Atherosclerosis， AS）斑塊的破裂和破裂后血管內血栓形成的危險性，然而相關分子機制尚不明確。微囊泡(Microvesciles，MVs)是細胞凋亡過程中產生的膜性囊狀結構，近年研究證實動脈粥樣斑塊中存在大量單核巨噬細胞源性MVs，其致病力較母細胞更強、更持久，與AS斑塊的進展密切相關。我們前期研究發(fā)現，TSE（Tobacco smoke extract，TSE）可增加單核細

2、胞源性MVs的產生，該MVs攜帶組織因子，體外具有強大的促凝活性，解釋了吸煙患者血液的高凝狀態(tài)和斑塊破裂后血栓形成的機制，但尚不能夠解釋吸煙患者AS斑塊破裂的機制。因此，本研究旨在探討TSE誘導巨噬細胞源性MVs是否具有蛋白水解酶活性，并探討TSE誘導的蛋白水解酶活性MVs的分子性質和產生的分子信號通路機制。
　　 方法:
　　 1.PMA誘導人THP-1單核細胞建立巨噬細胞模型和貼壁篩選法分離誘導外周血單核巨噬細胞;<

3、br>　　 2.酶譜法和熒光底物分解法測量TSE誘導MVs水解酶活性;
　　 3.在37℃應用Pro-MMP2與分離MVs體外共孵育1h，然后用酶譜法檢測TSE誘導MVs激活Pro-MMP2的活性;
　　 4.免疫熒雙染色共聚焦顯微鏡觀察TSE誘導巨噬細胞膜性基質金屬蛋白酶1(membrane type1 metalloproteinase，MT1-MMP)又稱MMP14和細胞凋亡早期標志物磷脂酰絲氨酸(PS)表達及分

4、布;
　　 5.Western Blot檢測TSE誘導巨噬細胞MMP14蛋白表達變化、MAPKs信號通路的激活和MVs攜帶MMP14情況;
　　 6.應用流式細胞技術測量TSE誘導總MVs和MMP14+MVs數量;
　　 7.應用凋亡抑制劑(caspase inhibitor，CASPi)，觀察TSE誘導MMP14+MVs的產生和活性;
　　 8.應用MAPKs信號通路p38/ERK/JNK特異性抑制劑干

5、預細胞后，觀察TSE誘導MVs產生和活性。
　　 結果:
　　 1.成功應用PMA建立THP-1巨噬細胞和貼壁篩選法分離誘導人外周血原代單核巨噬細胞;
　　 2.TSE誘導MVs可動態(tài)水解人工合成熒光底物肽段1和降解凝膠中天然底物明膠蛋白和膠原蛋白;
　　 3.TSE誘導MVs可激活人工重組Pro-MMP2的活性，級聯放大效應發(fā)揮水解膠原蛋白的活性;
　　 4.TSE誘導巨噬細胞呈濃度和時間依賴性

6、增加MMP14的表達，共聚焦顯微鏡顯示MMP14在巨噬細胞膜上呈結節(jié)性表達增加且與細胞膜的早期凋亡標志分子PS共定位，提示TSE誘導MVs攜帶MMP14;
　　 5.流式分析顯示TSE可誘導巨噬細胞源性總MVs和MMP14+MVs的產生;
　　 6.CASPi可明顯抑制TSE誘導巨噬細胞源性總MVs和MMP14+MVs的產生，并抑制MVs水解酶活性，不影響巨噬細胞表達MMP14;
　　 7.TSE可激活MAPKs

7、信號通路，使通路重要蛋白p38、ERK和JNK磷酸化，其中p38和JNK磷酸化與TSE誘導的巨噬細胞表達MMP14有關，與ERK的磷酸化無關;
　　 8.應用p38和JNK特異性抑制劑可明顯減少TSE誘導的MMP14+MVs的數量和活性。
　　 結論:
　　 TSE干預巨噬細胞可明顯增加蛋白水解酶活性MVs產生，與其攜帶的跨膜蛋白酶基質金屬蛋白酶家族的MMP14有關，具有強大膠原和明膠蛋白酶的活性;TSE誘導的水