表達(dá)雞艾美爾球蟲3-1E蛋白的乳酸菌染色體-質(zhì)粒平衡致死體系的建立.pdf

1、雞球蟲病由雞艾美爾球蟲引起，生產(chǎn)實(shí)踐中具有較高的發(fā)病率，對(duì)家禽業(yè)危害嚴(yán)重?，F(xiàn)階段，控制球蟲病的主要方法是藥物和活疫苗。然而，由于長(zhǎng)時(shí)間的藥物使用和疫苗免疫后致病等問(wèn)題，迫切需要找到一種更有效和更安全的替代策略來(lái)控制球蟲病。將乳酸菌作為抗原遞送載體傳遞疫苗抗原是一種安全有效的方法。本文探索了菲抗生素抗性篩選標(biāo)記的乳酸乳球菌表達(dá)體系的建立，并將在雞柔嫩艾美爾球蟲（E.tenella），堆型艾美耳球蟲（E.acervulina），雞巨型艾美爾

2、球蟲（E.maxima）中相對(duì)保守的3-1E抗原在建立的非抗性表達(dá)體系中進(jìn)行了表達(dá)。
　　研究首先依據(jù)Lactococcus lactis NZ9000(GenBank:CP002094.1)基因序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)thyA基因引物，以L.lactis NZ9000的基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增thyA基因上下游兩大片段（即thyA上游，thyA下游），并將這兩大片段分別克隆入pMD18-T克隆載體上，篩選獲得陽(yáng)性質(zhì)粒后進(jìn)行序列測(cè)定;分

3、別設(shè)計(jì)thyA基因引物（引入酶切位點(diǎn)）thyA-up-F/thyA-up-R和thyA-down-F/thyA-down-R，上步驟鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒為模板，分別擴(kuò)增獲得thyA-上游同源臂(thyA-up)、thyA-下游同源臂片段(thyA-down)。將這兩個(gè)片段分別克隆入pGhost9載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pGthyA-up-down(thyA基因缺失816 bp)，鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入L.lactisNZ9000感受態(tài)細(xì)胞中。根據(jù)

4、同源重組的原理，篩選單交叉菌落及雙交叉菌落。以篩選的雙交叉菌株和L.lactis NZ9000對(duì)照菌的基因組DNA為模板，擴(kuò)增thyA基因序列，并進(jìn)行序列測(cè)定分析。結(jié)果表明，篩選菌株基因組中thyA基因缺失了816 bp，與預(yù)期相符。成功篩選到了雙交叉菌株，即thyA營(yíng)養(yǎng)缺陷型乳酸乳球菌NZ9000/△thyA。
　　根據(jù)Lactobacillus acidophilus NCFM(GenBank:CP000033.3)序列查找t

5、hyA基因序列，通過(guò)在線啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件分析PLAB序列，設(shè)計(jì)thyA基因引物PLAB-thyALAB（上游引物中包含啟動(dòng)子序列以及thyA基因的起始密碼子開始的17 bp），以L.acidophilus NCFM的基因組DNA為模板，擴(kuò)增獲得PLAB-thyALAB融合基因片段。將PLAB-thyALAB基因片段克隆入pMD18-T克隆載體上，篩選獲得陽(yáng)性質(zhì)粒后進(jìn)行序列測(cè)定;設(shè)計(jì)thyA基因引物（引入酶切位點(diǎn)）PLAB-thyALAB-

6、1-F/R，上步驟鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增獲得PLAB-thyALAB基因片段。將PLAB-thyA片段克隆入pTX-8048-3-1E載體中的氯霉素的上游，構(gòu)建重組質(zhì)粒pTX-8048-3-1E-PLAB-thyALAB。鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入NZ9000/△thyA感受態(tài)細(xì)胞獲得陽(yáng)性重組菌NZ9000/△thyA-pTX-8048-3-1E-PLAB-thyALAB。將上步驟重組菌液涂布于不含胸腺嘧啶（thymidine）的SA

7、瓊脂平板，鑒定PLAB是否可以啟動(dòng)表達(dá)相應(yīng)thyA蛋白。挑取平板上單個(gè)菌落于BL液體培養(yǎng)基傳代20代，提取質(zhì)粒，酶切鑒定重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性。將所獲得的目的菌株超聲處理后，進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)印后進(jìn)行western-blot檢測(cè)E.tenella3-1E蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明:pTX-8048-3-1E-PLAB-thyALAB載體成功構(gòu)建，且PLAB啟動(dòng)子在NZ9000/△thyA-pTX-8048-3-1E-PLAB-thyALAB

8、菌體中可啟動(dòng)目的基因表達(dá)。傳代20代后，質(zhì)粒穩(wěn)定性良好并且E.tenella3-1E蛋白在該乳酸菌表達(dá)裁體成功表達(dá)。
　　根據(jù)上述pTX-8048-3-1E-PLAB-thyALAB質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)一對(duì)反向PCR引物Remove-CmF/R（其目的是除掉載體中的氯霉素），以pTX-8048-3-1E-PLAB-thyALAB質(zhì)粒為模板，反向PCR擴(kuò)增目的片段。目的片段經(jīng)NotⅠ單酶切后進(jìn)行載體自連，構(gòu)建非抗性選擇標(biāo)記的乳酸菌表達(dá)載體p

9、TX-8048-3-1E-PLAB-thyALAB（Cm已去除）。鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化NZ9000/△thyA感受態(tài)細(xì)胞獲得陽(yáng)性重組菌NZ9000/△thyA-pTX-8048-3-1 E-PLAB-thyALAB（Cm已去除）。將所獲得的目的菌株超聲處理后，進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)印后進(jìn)行western-blot鑒定E.tenella3-1E蛋白的表達(dá)，并將菌株傳代20代。之后再經(jīng)western-blot方法檢測(cè)目的蛋白E.tene

10、lla3-1E的表達(dá)情況。結(jié)果表明:非抗性選擇標(biāo)記的乳酸菌表達(dá)載體成功構(gòu)建，E.tenella3-1E蛋白在該非抗性載體成功表達(dá)，菌株在液態(tài)BL培養(yǎng)基連續(xù)傳代20代，仍未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒丟失，質(zhì)粒穩(wěn)定性良好。且傳代20代后E.tenella3-1E蛋白仍表達(dá)。
　　綜上所述，成功構(gòu)建了thyA營(yíng)養(yǎng)缺陷型乳酸乳球菌NZ9000/△thyA，并以NZ9000/△ thyA為受體菌株構(gòu)建了非抗性選擇標(biāo)記表達(dá)載體，并且成功表達(dá)了雞E.tenell