三嗪類化合物對(duì)雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)作用機(jī)制的研究.pdf

1、雞球蟲(chóng)病是由艾美爾屬球蟲(chóng)引起的一種胞內(nèi)寄生蟲(chóng)病，其中，柔嫩艾美爾球蟲(chóng)（Eimeriatenella,E tenella）的致病性較強(qiáng)，感染雞通常出現(xiàn)體重減少、盲腸損傷、便血和死亡等癥狀，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，許多抗球蟲(chóng)藥已經(jīng)被用于雞球蟲(chóng)病的防治，但是由于耐藥性的產(chǎn)生使得藥效明顯下降。此時(shí)，迫切需要尋找開(kāi)發(fā)新型抗球蟲(chóng)藥來(lái)彌補(bǔ)已經(jīng)出現(xiàn)耐藥性的舊藥。
　　沙咪珠利(Ethanamizuril，EZL)和納川珠利(Nitrom

2、ezuril，NZL)是本實(shí)驗(yàn)室自主合成的兩種新型三嗪類抗球蟲(chóng)化合物，前期研究表明二者均具有廣譜、高效、低毒的特點(diǎn)，具有很好的開(kāi)發(fā)前景。本論文在前期實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)上，研究了納川珠利對(duì)E tenella超微結(jié)構(gòu)的影響以及沙咪珠利和納川珠利對(duì)E tenella第二代裂殖子14種基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平以及對(duì)兩種表面抗原蛋白表達(dá)的影響，以期尋找藥物的作用階段和作用靶標(biāo)。結(jié)果如下:
　　1.在研究納川珠利對(duì)E.tenella超微結(jié)構(gòu)的影響時(shí)

3、，分別在感染后不同時(shí)間點(diǎn)單次給予10mg/kg納川珠利溶液，給藥后16小時(shí)剖殺，并與感染對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果表明，納川珠利對(duì)裂殖階段和配子階段均有影響:在裂殖階段，納川珠利能夠抑制裂殖體的分裂，減少裂殖子的數(shù)量，并導(dǎo)致裂殖子內(nèi)部微線和線粒體數(shù)目減少，棒狀體消失，淀粉顆粒聚集，外膜外翻，細(xì)胞漿空泡化等異常;在配子階段，納川珠利能夠使小配子母細(xì)胞染色質(zhì)濃染、邊緣化，核膜消失，大配子母細(xì)胞成壁體腫脹溶解等。
　　2.為研究沙咪珠利和

4、納川珠利對(duì)E tenella第二代裂殖子差異蛋白表達(dá)過(guò)程中基因水平的影響，從Label free鑒定出的上調(diào)和下調(diào)蛋白中分別選擇7種進(jìn)行基因水平的驗(yàn)證。以β-actin作為內(nèi)參基因，運(yùn)用Real-time PCR檢測(cè)上述蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，結(jié)果表明，選擇的蛋白基因水平的表達(dá)結(jié)果與Label free結(jié)果基本上一致。這14種基因主要參與蟲(chóng)體的糖酵解、氧化還原、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞骨架等，推測(cè)沙咪珠利和納川珠利可能通過(guò)干擾蟲(chóng)體代謝以及蟲(chóng)

5、體結(jié)構(gòu)來(lái)達(dá)到抗球蟲(chóng)作用。
　　3.為研究藥物對(duì)第二代裂殖子外膜的影響，選擇基因水平明顯下調(diào)的兩種表面抗原基因SAG19(Q70CD0)和SAGfm(U6L233)，利用RT-PCR的方法擴(kuò)增全長(zhǎng)，與pGEM-T easy載體連接，擴(kuò)增目的片段后分別雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物與pET-28a(+)，連接轉(zhuǎn)化至BL21后，誘導(dǎo)表達(dá)，分別獲得兩種重組蛋白。SDS-PAGE結(jié)果表明，兩種重組蛋白的分子量均約為32kd，為包涵體蛋白。分別以感染柔嫩艾美

6、耳球蟲(chóng)的雞血清和用重組蛋白來(lái)免疫兔子獲得的多克隆抗體作為一抗，利用Western blot分析，結(jié)果表明重組蛋白具有良好的反應(yīng)性和抗原性。
　　4.運(yùn)用Western-blot、免疫熒光檢測(cè)沙咪珠利和納川珠利對(duì)第二代裂殖子兩種表面抗原基因蛋白水平的影響。Western-blot結(jié)果表明，兩種藥物均能顯著降低兩種基因蛋白水平的表達(dá)。免疫熒光分析結(jié)果顯示，兩種表面抗原蛋白分布在整個(gè)裂殖子的表面，且與對(duì)照組相比，加藥組兩種藥物作用后兩種