KIR、HLA-Cw基因分型分析及HCV體外感染人CD4+T細(xì)胞靶細(xì)胞模型的建立的研究.pdf

1、目的：本次研究主要完成了1.對(duì)40例健康漢族人群KIR、HLA-Cw位點(diǎn)基因分型，分析并分選出KIR2DL3+/HLA-C1+個(gè)體；2.建立HCV體外感染人CD4+T細(xì)胞靶細(xì)胞模型。本次研究的兩部分內(nèi)容為KIR2DL3/HLA-C1基因組合與NK細(xì)胞體外抑制HCV復(fù)制相關(guān)性研究的關(guān)鍵前提和基礎(chǔ)。
　　方法：⑴取隨機(jī)抽取的40例健康漢族人群外周血樣本，采用商用試劑盒嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行KIR、HLA-Cw位點(diǎn)的基因分型；采用直接計(jì)數(shù)法

2、對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行綜合分析。⑵采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行HCVRNA對(duì)Huh-7.5細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)HCVRNA復(fù)制情況；Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)HCV NS3、NS5A蛋白的表達(dá)情況；免疫熒光法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)NS5A蛋白的細(xì)胞定位。檢測(cè)成功后，收集產(chǎn)生自上述HCV Huh-7.5細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)的HCV病毒顆粒，與分離自抗HCV陰性個(gè)體的CD4+T細(xì)胞共同孵育，RT-PCR檢測(cè)共孵育后CD4+T細(xì)胞內(nèi)H

3、CVRNA復(fù)制情況；Western blot檢測(cè)共孵育后CD4+T細(xì)胞內(nèi)HCV NS3、NS5A蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：①40例樣本中HLA-Cw位點(diǎn)HLA-C1基因出現(xiàn)頻率較HLA-C2高，且HLA-C1C1出現(xiàn)的頻率較HLA-C1C2高；KIR基因型中，以3DL1、2DL1、2DL3、2DL4、3DL2、3DL3、2DP1、3DP1、2DS4出現(xiàn)頻率較高，而3DS1、2DS1、2DS2、2DS3、2DS5、2DL2、2DL

4、5出現(xiàn)頻率較低；KIR2DL3+/HLA-C1C1例數(shù)較KIR2DL2+/HLA-C1C1多。以上可見，KIR2DL3+/HLA-C1+基因型組合以KIR2DL3-2DL3/HLA-C1C1者較多，占總樣本數(shù)52.5％。②在HCV Huh-7.5細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建中，RT-PCR檢測(cè)到轉(zhuǎn)染后Huh-7.5細(xì)胞內(nèi)HCVRNA的復(fù)制；Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Huh-7.5細(xì)胞內(nèi)HCV NS3及NS5A蛋白的表達(dá)；免疫熒光法對(duì)轉(zhuǎn)

5、染后細(xì)胞內(nèi)HCV NS5A蛋白成功進(jìn)行了定位。產(chǎn)生自HCV Huh-7.5細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)的HCV病毒顆粒與CD4+T細(xì)胞共同孵育，RT-PCR及Western blot技術(shù)分別檢測(cè)到共孵育后CD4+T細(xì)胞內(nèi)HCVRNA的復(fù)制及HCV NS3及NS5A蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：⑴根據(jù)KIR、HLA-Cw分型結(jié)果進(jìn)行分析，我們得到KIR2D L3+/HLA-C1+(KIR2DL3-2DL3/HLA-C1C1、KIR2DL3-2DL2/