6-羥多巴胺去除股動(dòng)脈交感神經(jīng)的動(dòng)物模型建立及相關(guān)研究.pdf

1、多種原因所導(dǎo)致的大范圍骨缺損、骨不連的修復(fù),一直是骨科領(lǐng)域的一項(xiàng)世界性難題,至今尚未得到有效解決。目前常用的修復(fù)方法有自體骨移植和異體骨移植,但這些方法都存有各自缺點(diǎn),限制了其臨床應(yīng)用,難以達(dá)到滿意的效果。骨組織工程的出現(xiàn)提供了全新的思路和方法,采用組織工程技術(shù)構(gòu)建的骨移植物可以滿足缺損的不同形狀和大小要求。
　　血液的供應(yīng)和神經(jīng)支配在人體組織和器官的發(fā)生、發(fā)育和成熟過程中都起到至關(guān)重要的作用;血管化、神經(jīng)化的組織工程骨的構(gòu)建是其

2、由實(shí)驗(yàn)室走向臨床的重要環(huán)節(jié)和關(guān)鍵技術(shù)。我們以往的研究證實(shí)了血管束、感覺神經(jīng)束移植在組織工程骨神經(jīng)化的形成中具有同等的作用,并可顯著促進(jìn)骨的形成。然而,該血管束富含交感神經(jīng)纖維,其神經(jīng)化作用是血管本身的作用、還是血管壁上的交感神經(jīng)的作用?仍然是一個(gè)未知的問題。因此,本實(shí)驗(yàn)通過6-OHDA化學(xué)性去交感神經(jīng)的方法去除兔股動(dòng)脈交感神經(jīng)纖維,建立兔股動(dòng)脈去交感神經(jīng)模型,對(duì)比去交感神經(jīng)血管與含交感神經(jīng)血管對(duì)組織工程骨神經(jīng)化的作用及其骨缺損修復(fù)效果進(jìn)

3、行單因素分析,以探明血管束的神經(jīng)化作用究竟是血管本身的作用,還是血管壁上交感神經(jīng)的獨(dú)立作用。
　　第一部分:明確股動(dòng)脈、股靜脈交感神經(jīng)分布情況,確定6-OHDA最佳濃度
　　目的:
　　1、通過乙醛酸單胺熒光染色方法明確股動(dòng)脈、股靜脈交感神經(jīng)分布。
　　2、通過對(duì)比不同濃度6-OHDA去交感神經(jīng)效果,確定藥物最佳濃度。
　　方法:
　　1、獲取健康新西蘭兔的股動(dòng)脈、股靜脈,剔除周圍組織,使用乙醛酸激發(fā)

4、單胺熒光染色檢測(cè)股動(dòng)脈、股靜脈交感神經(jīng)分布。2、分離新西蘭兔股動(dòng)脈采用不同濃度藥物處理。按照所使用6-OHDA濃度的不同,將實(shí)驗(yàn)組分為0.05mg/mL、0.075mg/mL、0.1mg/mL和0.125mg/mL組,每組各4只兔子。實(shí)驗(yàn)組采用Krebs緩沖液含不同濃度的6-OHDA和質(zhì)量百分比為0.1％的抗壞血酸處理;對(duì)照組采用Krebs緩沖液僅含0.1%的抗壞血酸,對(duì)照組使用4只兔子。分別用乙醛酸激發(fā)單胺熒光染色檢測(cè)股動(dòng)脈組織變化、

5、交感神經(jīng)分布,并通過Western blot表明檢測(cè)酪酸羥化酶(TH)蛋白表達(dá)水平的差異。
　　結(jié)果:
　　1、乙醛酸染色表明:股動(dòng)脈、股靜脈中均有交感神經(jīng)分布,股動(dòng)脈有密集的交感神經(jīng)呈網(wǎng)狀和放射狀分布,而股靜脈交感神經(jīng)分布比較稀疏。2、乙醛酸染色表明:與對(duì)照組相比,0.05mg/mL和0.075mg/mL組交感神經(jīng)減少不明顯,0.1mg/mL和0.125mg/mL組交感神經(jīng)顯著減少;對(duì)照組、0.05mg/mL組、0.075

6、mg/mL組、0.1mg/mL組和0.125mg/mL組熒光OD值平均分別為32.43±8.02、31.05±7.81、25.76±8.60、14.98±3.89、15.36±5.20。0.05mg/mL和0.075 mg/mL組交感神經(jīng)含量與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);0.1mg/mL和0.125mg/mL組交感神經(jīng)含量與對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。0.1mg/mL組和0.125mg/mL組相比,

7、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TH與內(nèi)參蛋白β-actin熒光強(qiáng)度掃描結(jié)果比值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果:對(duì)照組、0.05mg/mL組、0.075 mg/mL組、0.1mg/mL組和0.125mg/mL組TH/β-actin比值平均分別為0.70±0.08、0.63±0.12、0.61±0.11、0.19±0.08、0.19±0.06。Western blot表明:0.1mg/mL組和0.125 mg/mL組與對(duì)照組相比蛋白表達(dá)量均顯著減少(P<0

8、.05),0.05mg/mL組和0.075mg/mL組與對(duì)照組相比,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、股動(dòng)脈、股靜脈中均有大量交感神經(jīng)纖維分布。2、6-OHDA去除股動(dòng)脈交感神經(jīng)的最佳濃度為0.1mg/ml。
　　第二部分:股動(dòng)脈去交感神經(jīng)動(dòng)物模型的建立
　　目的:
　　探討6-OHDA在體內(nèi)去除兔股動(dòng)脈交感神經(jīng)的可行性,旨在為研究單純血管本身在組織工程骨中有無神經(jīng)化的作用提供理想的

9、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　方法:
　　分離新西蘭兔股動(dòng)脈采用不同藥物處理。實(shí)驗(yàn)組采用Krebs緩沖液含0.1mg/mL6-OHDA和質(zhì)量百分比為0.1%的抗壞血酸處理;對(duì)照組采用Krebs緩沖液僅含0.1%的抗壞血酸,對(duì)照組使用4只兔子。為確定藥物干預(yù)后交感神經(jīng)恢復(fù)的時(shí)間,將實(shí)驗(yàn)組分為7d、14d和28d取材組,每組各4只兔子。分別用蘇木精-伊紅(HE)染色法、乙醛酸激發(fā)單胺熒光染色檢測(cè)股動(dòng)脈組織變化、交感神經(jīng)分布,并通過West

10、ern blot表明檢測(cè)酪酸羥化酶(TH)和神經(jīng)肽Y(NPY)蛋白表達(dá)水平的差異。
　　結(jié)果:
　　HE染色表明:與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組股動(dòng)脈組織血管壁結(jié)構(gòu)完整,無明顯形態(tài)學(xué)改變。乙醛酸染色表明:對(duì)照組股動(dòng)脈可見大量交感神經(jīng)呈網(wǎng)狀和放射狀分布;7d和14d取材組交感神經(jīng)幾乎不可見,28d取材組有少量交感神經(jīng);對(duì)照組、7d取材組、14d取材組及28d取材組熒光OD值平均分別為32.40±7.42、15.30±3.79、15.20

11、±2.18、23.65±8.20。3個(gè)取材組交感神經(jīng)含量與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);28 d組與7d、14d組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TH和NPY與內(nèi)參蛋白β-actin熒光強(qiáng)度掃描結(jié)果比值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果:對(duì)照組、7d取材組、14d取材組及28d取材組TH/β-actin比值平均分別為0.70±0.08、0.19±0.08、0.20±0.06、0.33±0.06;對(duì)照組、7d取材組、14d取材組及28d

12、取材組NPY/β-actin比值平均分別為0.68±0.14、0.14±0.02、0.17±0.02、0.53±0.10。Western blot表明:兩種蛋白表達(dá)量變化趨勢(shì)相同,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比蛋白表達(dá)量均顯著減少(P<0.05),28d組與7d、14d組相比表達(dá)量增多,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　體內(nèi)局部應(yīng)用6-OHDA可有效去除股動(dòng)脈交感神經(jīng)纖維,是一種可行的血管壁去交感神經(jīng)實(shí)驗(yàn)方法;建立