TDP-25對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元延遲整流鉀電流電生理特性的影響及雙甲氧姜黃素的保護(hù)作用.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化(AmyotrophicLateralSclerosis，ALS)是一個(gè)逐漸進(jìn)展的、具有嚴(yán)重致死性的神經(jīng)變性疾病，以進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失為特征，發(fā)病機(jī)制不明。TDP-43(TARDNAbingdingproteinof43kDa)被認(rèn)為是在肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophiclateralsclerosis，ALS)及額顳葉癡呆患者大腦中發(fā)現(xiàn)的泛素化包涵體的主要成分，主要功能為參與特定的前mRNA的剪接、轉(zhuǎn)錄、維持其穩(wěn)定

2、性及微小mRNA的生物合成。目前在TDP-43上發(fā)現(xiàn)了40種與散發(fā)性及家族性ALS有關(guān)的顯性突變，為T(mén)DP-43的功能異常及神經(jīng)變性病之間的直接聯(lián)系提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。TDP-25是在ALS患者的受累大腦區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的分子量為25kDa的TDP-43的C末端片段。研究發(fā)現(xiàn)，TDP-25可以促進(jìn)TDP-43包涵體形成，對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有毒性作用，引起神經(jīng)元變性，在疾病的發(fā)病過(guò)程中起重要作用，但其機(jī)制尚未明確。最初的觀點(diǎn)認(rèn)為:興奮性毒性可以引起

3、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷。然而，對(duì)ALS患者的神經(jīng)傳導(dǎo)的研究發(fā)現(xiàn)，軸索膜興奮性的提高，及過(guò)興奮性的程度與病人的生存期呈負(fù)相關(guān)。興奮性的提高包括持續(xù)性鈉電流的增加及鉀電流的減小。然而對(duì)TDP-43模型是否存在高興奮性尚不清楚。隨著對(duì)ALS研究的不斷深入及對(duì)K+通道的進(jìn)一步了解，ALS與鉀通道的關(guān)系日益受到人們的關(guān)注，延遲整流電流(delayedrectifierpotassiumcurrent，IKdr)是影響動(dòng)作電位復(fù)極化過(guò)程的主要的電流，但有關(guān)

4、ALS模型細(xì)胞水平上對(duì)鉀電流的研究甚少。同時(shí)，雙甲氧姜黃素(DimethoxyCurcumin，DMC)是姜黃素的類(lèi)似物，近年來(lái)因其具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功效而受了廣泛關(guān)注，本實(shí)驗(yàn)室研究也發(fā)現(xiàn)其對(duì)轉(zhuǎn)染TDP-43的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞線粒體有保護(hù)作用，可以增強(qiáng)其自噬清除毒性蛋白的能力，此外姜黃素還可以上調(diào)Nrf2和Ⅱ相酶的水平，減少氧化應(yīng)激產(chǎn)生的損害，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞。
　　目的:檢測(cè)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25基因的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的

5、延遲整流鉀電流性質(zhì)是否發(fā)生改變及動(dòng)作電位相關(guān)指標(biāo)的改變，以探討TDP-25對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用的機(jī)制;進(jìn)一步探討DMC對(duì)電壓門(mén)控鉀通的道調(diào)節(jié)作用。
　　方法:應(yīng)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25基因和空質(zhì)粒(Emptyvector)的兩種細(xì)胞，該細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，參考NSC34細(xì)胞株的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，采用抗生素加壓的方法篩選單克隆細(xì)胞，將篩選所得單克隆細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)、傳代。在全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)電壓鉗模式下記錄上述兩種細(xì)胞延遲整流鉀電流

6、并分析其性質(zhì)改變。在電流鉗模式下測(cè)定兩種細(xì)胞的動(dòng)作電位，分別給予兩種細(xì)胞20pA、40pA、60pA和80pA4個(gè)階梯遞增的電流刺激動(dòng)作電位發(fā)生，并記錄其閾電位、潛伏期、幅度及動(dòng)作電位半峰時(shí)程（actionpotentialdurationat50％repolarization，APD50）等指標(biāo)以進(jìn)行比較。將成功培養(yǎng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25和Empty的NSC34細(xì)胞系傳代，接種于六孔板的小玻璃片上，12小時(shí)后給予換液并給予上述兩種細(xì)胞

7、濃度為10mM的DMC24小時(shí)。給予與對(duì)照組相同的刺激程序，觀察DMC對(duì)延遲整流鉀通道電流的影響。
　　結(jié)果:1、TDP-25組細(xì)胞的電流密度小于Empty組，在60mV時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（TDP-25組10.65±3.24，Empty組13.26±6.51P＜0.05）。2、與Empty組相比，TDP-25組半數(shù)激活電壓V1/2向超極化方向移動(dòng)3.73mV左右(TDP-25組8.18±4.95mV，n=14，Empty組11.91±

8、4.34mV，n=19，P＜0.05)，表明TDP-25組細(xì)胞的鉀通道更容易在較負(fù)的電位下被激活。斜率K無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(TDP-25組11.46±2.41，Empty組12.82±1.89.P＞0.05)。3、TDP-25組（n=14）與Empty(n=11)組細(xì)胞的動(dòng)作電位的閾電位值在各個(gè)刺激電流下無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;TDP-25組細(xì)胞的潛伏期值高于Empty組，在40pA時(shí)兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為38.99±9.48ms和30.13±6

9、.96ms，P＜0.05);TDP-25組細(xì)胞的幅度低于Empty組，其中在20pA時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（分別為42.96±7.29mV和47.10±8.69mV，P＜0.05）。TDP-25組細(xì)胞的APD50顯著長(zhǎng)于Empty組，在40pA、60pA、80pA時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（分別為80.41±25.51ms，64.03±23.35ms，55.16±18.97ms和53.18±7.65ms，44.13±5.58ms，36.56±9.24ms）

10、。推斷主要與TDP-25組細(xì)胞IKdr的激活動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變有關(guān)。4、在給予TDP-25組細(xì)胞10uM的DMC處理24小時(shí)后，電流密度大于未給藥組細(xì)胞，表明DMC有增加延遲整流鉀電流的趨勢(shì)，但兩組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5、給藥后IKdr的穩(wěn)態(tài)激活曲線發(fā)生了正向偏移，相應(yīng)地，半數(shù)激活電壓V1/2向去極化方向移動(dòng)了8.93mV左右，未給藥組V1/2=8.18±4.96mV，給藥組V1/2=17.11±7.99mV(P＜0.05)，表明DMC改變了

11、延遲整流鉀電流的激活性質(zhì)，具有促進(jìn)鉀通道開(kāi)放的作用;激活曲線的斜率k由11.46±2.4增加為16.12±2.40(P＜0.01)，表明DMC使此鉀通道對(duì)電壓的敏感性增強(qiáng)。
　　結(jié)論:在本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)谶\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞上成功檢測(cè)出延遲整流鉀電流，并發(fā)現(xiàn)TDP-25通過(guò)改變延遲整流鉀電流的激活性質(zhì)，抑制了延遲整流鉀通道的活性，減小電流密度，延長(zhǎng)動(dòng)作電位的復(fù)極化時(shí)程，增大了細(xì)胞的放電頻率，從而引起神經(jīng)元興奮性增高，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生興奮毒性