Na+，K+-ATP酶在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞中的作用.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)是一種特異性累及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)變性疾病，可累及皮質(zhì)、脊髓、腦干、脊髓束的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。在所有ALS患者中，90％為散發(fā)病例，其余10％為家族型。已有研究提出ALS病因可能與編碼TDP-43的基因突變有關(guān)，且突變率隨著年齡增長而增加，表明其它基因或環(huán)境因素可能會(huì)促進(jìn)疾病的發(fā)展。
　　TDP-43是由TARDBP基因編碼的多功能DNA-RNA結(jié)合蛋白，正常情況下只存在于細(xì)胞核內(nèi)。在ALS和FTLD-U患者腦組織

2、中，發(fā)現(xiàn)病理性TDP-43異常移位到細(xì)胞質(zhì)并在此聚集，可形成不溶性的泛素化包涵體。病理性TDP-43可經(jīng)蛋白酶水解裂開，形成分子量為25kDa的C末端片段，即TDP-25，仍具備易聚集性和細(xì)胞毒性。許多研究發(fā)現(xiàn)，TDP-43和TDP-25是許多神經(jīng)變性疾病的顯著病理學(xué)特征，例如FTLD-TDP和肌萎縮側(cè)索硬化。ALS患者腦組織中TDP-25的產(chǎn)生和聚集，可能是神經(jīng)元變性的重要原因。盡管推測(cè)TDP-25在神經(jīng)元變性中起重要作用，但目前對(duì)此

3、肽鏈的作用還不十分明確。Na+，K+-ATP酶是細(xì)胞生存的核心，對(duì)維持神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)外離子穩(wěn)態(tài)、膜電位離子平衡及細(xì)胞的細(xì)胞膜興奮性等許多生理過程具有重要的作用。當(dāng)Na+，K+-ATP酶功能受到抑制時(shí)，Na+向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)減少并在細(xì)胞內(nèi)大量聚集，通過Na+/Ca2+交換體逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，引起細(xì)胞的損傷乃至凋亡。Na+，K+-ATP酶在神經(jīng)元中可表達(dá)α1、α3兩種不同亞型的亞基，根據(jù)對(duì)哇巴因親和力的不同，分為低親和力結(jié)合亞基和高

4、親和結(jié)合亞基，在不同組織和不同發(fā)育階段，不同亞型的α亞基發(fā)揮不同的作用。
　　已有證據(jù)表明ALS患者在發(fā)病早期還未出現(xiàn)臨床表現(xiàn)時(shí)，就已出現(xiàn)皮質(zhì)或脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元興奮性異常增高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)染突變SOD1基因的ALS小鼠在出現(xiàn)臨床癥狀前就已出現(xiàn)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元興奮性升高。而SOD1作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的可引起ALS的突變基因，其活性的缺失被認(rèn)為是ALS的致病機(jī)理之一。神經(jīng)元興奮性增高可增加ATP的消耗，加重線粒體負(fù)擔(dān)，促進(jìn)臨床癥狀的進(jìn)展

5、。不僅如此，在ALS小鼠脊髓神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜上Na+，K+-ATP酶活性明顯減低。而目前關(guān)于Na+，K+-ATP酶在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞中活性特征的研究較少。
　　目的:分別檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染TDP-25蛋白和空質(zhì)粒的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞的Na+，K+-ATP酶活性，并比較兩種細(xì)胞間是否存在差別，以探究TDP-25細(xì)胞興奮性水平的變化;驗(yàn)證Na+，K+-ATP酶是否存在兩種不同的亞基及其在TDP-25細(xì)胞中的變化;分

6、析TDP-25蛋白在ALS發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)選用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Empty vector（空質(zhì)粒）、TDP-25兩種NSC34細(xì)胞系，空質(zhì)粒細(xì)胞系作為正常對(duì)照。這兩種細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，采用脂質(zhì)體將TDP-25基因轉(zhuǎn)染到NSC34細(xì)胞。參考NSC34細(xì)胞系的方法對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，通過篩選、免疫組化技術(shù)鑒定等方法，將單克隆細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)、傳代。運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，記錄兩種細(xì)胞在靜息狀態(tài)下和給予10-9、10-8、10-7、

7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L濃度梯度哇巴因灌流液后Na+，K+-ATP酶活性被抑制后的膜電流，通過統(tǒng)計(jì)作圖比較，檢測(cè)其Na+，K+-ATP酶活性以及不同亞基的特性。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染TDP-25基因的細(xì)胞（TDP-25組）和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞（Empty組）酶電流的比較。將給予不同濃度哇巴因的灌流液前后所記錄的膜電流經(jīng)統(tǒng)計(jì)后結(jié)果如下，TDP-25組:10-9mol/L(n=6):0.10538±0.07058,10

8、-8mol/L(n=6):0.10122±0.07452,10-7mol/L(n=6):0.23377±0.0683,10-6mol/L(n=6):0.48538±0.1471,10-5mol/L(n=6):0.47068±0.08315,10-4mol/L(n=6):0.64007±0.04886Empty組:10-9mol/L(n=9):0.10662±0.08123,10-8mol/L(n=6):0.15378±0.04578,1

9、0-7mol/L(n=7):0.32086±0.09789,10-6mol/L(n=6):0.28407±0.12265,10-5mol/L(n=7):0.60686±0.11757,10-4mol/L(n=8):0.69882±0.1077將TDP-25組和E組結(jié)果分別進(jìn)行非線性指數(shù)擬合，得出雙指數(shù)擬合圖形及方程，擬合方程為:IP=fh×k[Oua]K-high/[Oua]+K-high+fl×k[Oua]K-low/[Oua]+K-

10、low其中，IP代表Na+，K+-ATP酶電流，k代表當(dāng)高親和力或低親和力結(jié)合位點(diǎn)與Oua結(jié)合時(shí)一個(gè)Na+，K+-ATP酶分子產(chǎn)生的電流，K-high代表高親和力Na+，K+-ATP酶抑制性O(shè)ua結(jié)合位點(diǎn)的解離系數(shù)，K-low代表低親和力Na+，K+-ATP酶抑制性O(shè)ua結(jié)合位點(diǎn)的解離系數(shù)，fh代表高親和力Na+，K+-ATP酶占總Na+，K+-ATP酶電流的百分比，fl代表低親和力Na+，K+-ATP酶占總Na+，K+-ATP酶電流的

11、百分比，[Oua]代表Ouabain的濃度。
　　根據(jù)K-high和K-low的不同，將Na+，K+-ATP酶分為高親和力和低親和力兩種。
　　擬合結(jié)果如下:
　　Empty組:高、低親和力Na+，K+-ATP酶的Oua抑制性結(jié)合位點(diǎn)解離系數(shù)分別為58.79 nmol/L和197.67μmol/L，二者占總Na+，K+-ATP酶電流的百分比分別為21.8％和78.2％.
　　TDP25組:高、低親和力Na+，K+