二相酶誘導劑DATS對運動神經(jīng)元的保護作用.pdf

1、目的：肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種慢性進行性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。它的主要病理改變是選擇性地損傷運動神經(jīng)元(包括大腦皮層運動神經(jīng)元、腦干運動神經(jīng)核和脊髓前角運動神經(jīng)元)。臨床表現(xiàn)為緩慢進展的四肢無力，逐漸喪失運動功能，累及呼吸肌，多于發(fā)病3-5年死亡。ALS可分為家族型肌萎縮側索硬化(Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis，F(xiàn)ALS)和散發(fā)型

2、肌萎縮側索硬化(Sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis，SALS)，90％以上為散發(fā)型，不足10％為家族型。 目前該病病因不清，尚無切實有效的治療方案。在ALS發(fā)病機制中存在著多因素的相互作用，包括氧化應激和自由基的損傷、谷氨酸興奮毒作用、線粒體功能異常、營養(yǎng)因子缺乏、神經(jīng)絲聚集、免疫異常等。較為重要的是谷氨酸興奮毒性和氧化應激自由基的損傷，其中氧化應激被認為是各種原因誘發(fā)的神經(jīng)變性疾病的最

3、終通路。目前ALS治療方向主要包括興奮性氨基酸拮抗劑、抗氧化劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子、基因治療、免疫治療、以及干細胞移植治療等方面。針對氧化應激這一發(fā)病環(huán)節(jié)，在ALS的治療中開始應用一些外源性抗氧化劑如N-乙酰半胱氨酸、維生素E、褪黑素等。這些外源性抗氧化劑在體外或體內實驗中表現(xiàn)出了一定程度的神經(jīng)保護作用，但療效并不滿意。另一個可能抵抗氧化應激的有效治療策略，就是通過化學誘導劑誘導一系列內源性抗氧化酶、抗氧化蛋白的表達，發(fā)揮協(xié)同的強大的抗氧化作

4、用。國內外資料證實，已明確基因的二相酶有20余種，通過某一共同的通路，這些酶起到多方面的抗氧化作用，并且可以被許多化合物所誘導。在這一通路上，一段共同的調節(jié)序列被命名為抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)，ARE對包括二相酶NQO1在內的抗氧化酶基因的構成和誘導起到了非常重要的作用。二相酶誘導劑可以通過影響ARE途徑，促進轉錄因子Nrf2(NF-E2-related factor2)與ARE

5、結合，進而上調抗氧化酶的基因，促進二相酶的表達。二烯丙基三硫化物(diallyl trisulfide，DATS)是大蒜中的提取物，大蒜中含有豐富的水溶性和脂溶性有機硫化物，這些有機硫化物的主要成分是二烯丙基硫化物(diallyl sulfide，DAS)，二烯丙基二硫化物(diallyl disulfide，DADS)和二烯丙基三硫化物(diallyl tirsulfide，DATS)。DATS是這三種成分中活性最強的，也是應用最廣的

6、。最初被認為具有抗癌，防癌的作用，現(xiàn)已肯定它可以誘導二相解毒酶和諸多抗氧化蛋白的表達，提高細胞的抗氧化能力，從而具有潛在的治療神經(jīng)變性疾病的作用，值得研究推廣。我們選用此類化合物應用于ALS的體外器官型脊髓片培養(yǎng)模型，對運動神經(jīng)元的存活數(shù)量進行觀察，探討其對運動神經(jīng)元損傷是否存在保護作用。 方法：實驗動物選用7日齡的SD乳鼠快速斷頭，在無菌條件下迅速取出脊髓，用活組織切片機切成350μm厚的薄片，放置于6孔培養(yǎng)板內的Millip

7、ore Millicell-CM insert上，每個insert上放5片，入CO2培養(yǎng)箱(37℃，5％CO2、95％空氣)。經(jīng)過1周的損傷恢復期后，在培養(yǎng)液中加入谷氨酸轉運體抑制劑蘇-羥天冬氨酸(THA)，升高細胞間隙谷氨酸濃度，造成脊髓前角運動神經(jīng)元特異性損傷，制備成ALS體外器官模型。在此基礎上，將不同濃度的DATS(分別為5、10、25、50umol/L)加入培養(yǎng)液中干預兩天后，通過westernblot檢測二相酶NQO1的上調

8、情況并測定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)及丙二醛(MDA)含量，選取可以上調二相酶同時對脊髓片又無毒性作用的合適濃度。之后，脊髓片隨機分為正常對照組、模型組(100 umol/L THA)和二相酶誘導劑DATS提前干預組。用神經(jīng)元的特異性抗體SMI-32組化染色，對脊髓前角運動神經(jīng)元進行鑒定、計數(shù)，western blot觀察二相酶NQO1上調情況。 結果：用不同濃度DATS干預兩天后培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)及丙二醛(MDA)

9、含量與正常對照組沒有明顯差異，且50umol/L的DATS可以上調二相酶NQO1的水平。此外，正常對照組脊髓片體外生長良好，面積逐漸增大，兩側前角共有15-20個左右的運動神經(jīng)元。THA模型組脊髓片在體外生長不良，與對照組相比，前角運動神經(jīng)元數(shù)明顯減少(P＜0.05)。而50umol/L的DATS提前干預組脊髓片生長與正常對照組相近，與模型組相比前角運動神經(jīng)元數(shù)明顯增加(P＜0.05)，并且與正常對照組相比可以上調二相酶NQO1的水平。