薄荷醇通過影響皮膚KC內(nèi)PLC活性而產(chǎn)生促透作用的研究.pdf

1、目的:
　　從細胞和分子水平探討薄荷醇對體外培養(yǎng)皮膚角質(zhì)形成細胞(KC)中磷脂酶C(PLC)活性的影響,找出KC內(nèi)Ca2+的變化與皮膚結(jié)構(gòu)改變的關(guān)系,較系統(tǒng)地探討薄荷醇的促透作用機制,為確立中藥促透劑薄荷醇在藥劑學(xué)中的應(yīng)用提供較充分的科學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　1.體外皮膚滲透性實驗
　　采用改良的Franz擴散池,選用家兔背部皮膚,以對乙酰氨基酚作為模型藥物進行體外皮膚滲透性實驗,計算出各組的累積滲透量、穩(wěn)態(tài)流

2、量和滯留時間,比較薄荷醇等促透劑對對乙酰氨基酚經(jīng)皮吸收的效果。
　　2.Ca2+含量檢測實驗
　　體外培養(yǎng)KC,實驗細胞分為空白組、1‰DMSO組、50μM、100μM、200μM薄荷醇組、200μM薄荷醇+U73122組、U73122組、200μM薄荷醇+硝苯地平組和硝苯地平組。根據(jù)分組加入培養(yǎng)基,利用流式細胞儀結(jié)合Fluo-3/AM染色技術(shù),半定量檢測各組KC內(nèi)的Ca2+濃度。
　　3.磷脂酶C(PLC)活性檢測實

3、驗
　　體外培養(yǎng)KC,實驗細胞分為空白組、1‰DMSO組、50μM、100μM、200μM薄荷醇組、200μM薄荷醇+U73122組和U73122組。根據(jù)分組加入培養(yǎng)基4h后,裂解,離心,收集上清液,用人PLC酶聯(lián)免疫分析試劑盒進行檢測各組的PLC活性;用含200μM薄荷醇培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞4h后,換入正常培養(yǎng)基,分別收集0、2、4、8、12、24h的細胞,同法檢測不同時間KC的PLC活性。
　　4.Ca2+-ATP酶活性檢測實

4、驗
　　體外培養(yǎng)KC,實驗細胞分為空白組、1‰DMSO組、50μM、100μM、200μM薄荷醇組、200μM薄荷醇+U73122組和U73122組。根據(jù)分組給藥4h后,破碎細胞,收集上清液,用超微量Ca2+-ATP酶試劑盒檢測各組KC的Ca2+-ATP酶活性。
　　5.ATP含量檢測實驗
　　體外培養(yǎng)KC,實驗細胞分為空白組、1‰DMSO組、50μM、100μM、200μM薄荷醇組、200μM薄荷醇+U73122組和

5、U73122組。根據(jù)分組給藥4h后,破碎細胞,收集上清液,用ATP含量試劑盒檢測各組KC的ATP含量。
　　6.蛋白激酶C(PKC)活性檢測實驗
　　體外培養(yǎng)KC,實驗細胞分為空白組、1‰DMSO組、50μM、100μM、200μM薄荷醇組、200μM薄荷醇+U73122組、U73122組、200μM薄荷醇+白屈菜紅堿組和白屈菜紅堿組。根據(jù)分組加入培養(yǎng)基4h后,裂解,收集上清液,用人PKC酶聯(lián)免疫分析試劑盒進行檢測各組的PK

6、C活性;用含200μM薄荷醇培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞4h后,換入正常培養(yǎng)基,分別收集0、2、4、8、12、24h的細胞,同法檢測不同時間KC的PKC活性。
　　7.細胞膜流動性檢測實驗
　　體外培養(yǎng)KC,實驗細胞分為空白組、1‰DMSO組、50μM、100μM、200μM薄荷醇組、200μM薄荷醇+白屈菜紅堿組和白屈菜紅堿組。根據(jù)分組加入培養(yǎng)基4h后,收集細胞,加入1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)負載液,避光37℃孵育30

7、min后,用帶偏振裝置的熒光分光光度計檢測各組細胞膜的熒光強度(激發(fā)波長362nm,發(fā)射波長432nm),并計算得出各組的熒光偏振度和微粘度。
　　8.考馬斯亮藍染色實驗
　　接種KC于預(yù)置玻片的六孔板中,貼壁后分為空白組、1‰DMSO組、200μM薄荷醇組、200μM薄荷醇+白屈菜紅堿組和白屈菜紅堿組。采用考馬斯亮藍染色方法,顯微鏡觀察各組KC的微絲骨架結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果:
　　1.不同促透劑對皮膚滲透性的影

8、響
　　體外促透實驗結(jié)果顯示,與空白組相比,丙二醇組累積滲透量無顯著性差異(p>0.05),樟腦組的累積滲透量有所增加(p<0.05),氮酮組、薄荷醇組和油酸組的累積滲透量明顯增加(p<0.01);與氮酮組相比,薄荷醇組累積滲透量較大(p<0.05),油酸組累積滲透量無顯著性差異(p>0.05),丙二醇組和樟腦組累積滲透量較小(p<0.01)。與空白組相比,丙二醇組穩(wěn)態(tài)流量無顯著性差異(p>0.05),樟腦組的穩(wěn)態(tài)流量有所增加(p

9、<0.05),氮酮組、薄荷醇組和油酸組的穩(wěn)態(tài)流量明顯增加(p<0.01);與氮酮組相比,油酸組的穩(wěn)態(tài)流量無顯著性差異(p>0.05),薄荷醇組的穩(wěn)態(tài)流量較大(p<0.05),丙二醇組和樟腦組的累積滲透量較小(p<0.01)。與空白組相比,氮酮組、薄荷醇組和丙二醇組的滯留時間無顯著性差異(p>0.05),樟腦組的滯留時間有所縮短(p<0.05),油酸組的滯留時間明顯增加(p<0.01);與氮酮組相比,薄荷醇組和樟腦組的滯留時間無顯著性差異

10、(p>0.05),油酸組的滯留時間明顯較長(p<0.01),丙二醇組的滯留時間較長(p<0.05)。
　　2.薄荷醇對KC內(nèi)Ca2+水平的影響
　　流式細胞儀結(jié)果顯示,與空白組相比,DMSO組、U73122組和硝苯地平組的熒光強度無顯著性差異(p>0.05),熒光強度隨薄荷醇濃度而增加(p<0.01);薄荷醇+U73122組和薄荷醇+硝苯地平組的熒光強度雖低于同濃度的薄荷醇組(p<0.01),但仍高于空白組(p<0.01)。

11、
　　3.薄荷醇對KC的PLC活性的影響
　　PLC活性檢測實驗顯示,與空白組相比,DMSO組PLC活性無顯著變化(P>0.05),U73122組的PLC活性明顯降低(P<0.01),KC的PLC活性隨薄荷醇濃度的增大而增加(P<0.01);薄荷醇+U73122組的PLC活性與同濃度的薄荷醇組相比明顯降低(P<0.01)且與空白組無顯著性差異(P>0.05)。200μM薄荷醇組換入正常培養(yǎng)基后,PLC活性隨時間緩慢恢復(fù)正常水

12、平。
　　4.薄荷醇對KC內(nèi)Ca2+-ATP酶活性的影響
　　Ca2+-ATP酶活性檢測實驗顯示,與空白組相比,DMSO組的Ca2+-ATP酶活性有所降低(P<0.05),U73122組的Ca2+-ATP酶活性有所增加(P<0.05),Ca2+-ATP酶活性隨薄荷醇濃度的增大而降低(P<0.01);薄荷醇+U73122組的Ca2+-ATP酶活性與同濃度的薄荷醇組相比雖有所增加(P<0.05),但仍低于空白組(P<0.01)。

13、
　　5.薄荷醇對KC內(nèi)ATP含量的影響
　　ATP含量檢測實驗顯示,與空白組相比,DMSO組的ATP含量無顯著變化(P>0.05),U73122組的ATP含量有所增加(P<0.05),ATP含量隨薄荷醇濃度的增大而減少(P<0.01);薄荷醇+U73122組的ATP含量與同濃度的薄荷醇組相比有所增加(P<0.05),但仍低于空白組(P<0.01)。
　　6.薄荷醇對KC的PKC的影響
　　PKC活性檢測實驗顯示

14、,與空白組相比,DMSO組的PKC活性無顯著變化(P>0.05),U73122組的PKC活性有所降低(P<0.05),白屈菜紅堿組的PKC
　　活性明顯降低(P<0.01),KC的PKC活性隨薄荷醇濃度的增大而增加(P<0.01);薄荷醇+U73122組和薄荷醇+白屈菜紅堿組的PKC活性與同濃度的薄荷醇組相
　　比明顯降低(P<0.01)但明顯高于空白組(P<0.01)。200μM薄荷醇組換入正常培養(yǎng)基后,PKC活性隨時間緩

15、慢恢復(fù)正常水平。
　　7.薄荷醇對KC膜流動性的影響
　　膜流動性實驗結(jié)果顯示,與空白組相比,DMSO組和白屈菜紅堿組的熒光偏振度無顯著變化(P>0.05),50μM薄荷醇組的熒光偏振度有所減小(P<0.05),100μM、200μM薄荷醇組和薄荷醇+白屈菜紅堿組熒光偏振度明顯減小(P<0.01);薄荷醇+白屈菜紅堿組的熒光偏振度與同濃度的薄荷醇組相比較小(P<0.05);與空白組相比,DMSO組和白屈菜紅堿組的微粘度無顯著

16、性差異(P>0.05)。各薄荷醇組的微粘度明顯減小(P<0.01)。薄荷醇+白屈菜紅堿組的微粘度與同濃度的薄荷醇組相比較小(P<0.05)。
　　8.薄荷醇對KC微絲骨架結(jié)構(gòu)的影響
　　考馬斯亮藍染色結(jié)果顯示,空白組可清楚看見細胞質(zhì)內(nèi)骨架蛋白顯藍色,細胞核染色較致密,細胞形態(tài)不規(guī)則。細胞間無重疊,相鄰細胞之間有密集的骨架束相互穿行。與空白組相比,DMSO組以及白屈菜紅堿組的細胞骨架沒有明顯的變化。與空白組相比,薄荷醇組細胞體

17、積縮小,細胞連接明顯減少,細胞間隙明顯增寬,細胞間緊密連接程度下降。與薄荷醇組相比,薄荷醇+白屈菜紅堿組的細胞連接較多,細胞間隙縮小,細胞間連接程度增加,但與空白組比仍有一定的差異。
　　結(jié)論:
　　1.不同促透劑即使?jié)舛认嗤珜ν凰幬锏慕?jīng)皮吸收有不同的促透效果。
　　2.薄荷醇可以通過增加PLC的活性,激活KC內(nèi)鈣通道使Ca2+濃度增加而發(fā)揮促透作用。
　　3.薄荷醇可以通過增加PLC的活性,使KC的Ca2+