薄荷醇通過TRPM8通道誘導(dǎo)人膀胱癌T24細(xì)胞株死亡的試驗(yàn)研究.pdf

1、膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見惡性病變,居男性惡性腫瘤發(fā)病率第四位,死亡率第八位。盡管大部分新發(fā)患者可以通過經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切(TUR-Bt)治療,但術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率高,因此,如何降低患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率是目前膀胱癌相關(guān)研究的焦點(diǎn)。目前研究已顯示術(shù)后膀胱灌注化療和免疫治療可以降低患者術(shù)后復(fù)發(fā)率,但現(xiàn)有藥物對(duì)術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率緩解作用有限,且部分副作用難以耐受,需要進(jìn)一步尋找安全高效的藥物來降低膀胱癌患者TUR-Bt術(shù)后復(fù)發(fā)的難題。
　　 薄荷醇是

2、從唇形科植物薄荷中提取的薄荷揮發(fā)油中主要成分,是一種已被應(yīng)用了幾千年的植物藥,并被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)視為安全無毒藥物,在醫(yī)藥食品等多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。研究表明薄荷醇對(duì)前列腺癌、黑色素瘤、白血病、胃癌等癌細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用,但同時(shí)也有試驗(yàn)提示薄荷醇可以促進(jìn)神經(jīng)內(nèi)分泌瘤細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的分泌功能及遷徙能力,促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。而就其機(jī)制而言,研究已顯示薄荷醇不但能通過其特異性受體一瞬時(shí)受體電位通道M8(TRPM8,或稱為CMR1

3、或Trpp8)抑制腫瘤生長(zhǎng),尚可通過非TRPM8通道抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此,薄荷醇與惡性腫瘤之間的研究才拉開序幕。
　　 本課題擬分三部分來探討薄荷醇對(duì)膀胱癌增殖的影響及機(jī)制,以期為膀胱癌的臨床治療和薄荷醇的新藥開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。本課題的創(chuàng)新點(diǎn):1)首次觀察了人膀胱癌細(xì)胞系T24細(xì)胞中TRPM8通道的表達(dá)和功能情況；2)首次觀察了薄荷醇對(duì)T24細(xì)胞增殖的影響；3)深入探討了薄荷醇調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的可能機(jī)制。
　　 第一

4、章 人膀胱癌T24細(xì)胞中TRPM8的表達(dá)及活性的研究
　　 目的:探討人膀胱癌T24細(xì)胞中是否存在TRPM8通道的表達(dá)及其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分布和功能
　　 方法:體外常規(guī)培養(yǎng)人膀胱癌T24細(xì)胞、HEK293細(xì)胞及HEK293-TRPM8細(xì)胞,使用Trizol法和RIPA法分別提取細(xì)胞總RNA和總蛋白,進(jìn)一步使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和western蛋白印跡試驗(yàn)(western blotting)分別檢測(cè)TRPM8基因的mRN

5、A和蛋白表達(dá)情況。并使用免疫熒光雜交檢測(cè)在共聚焦顯微鏡下觀察人膀胱癌T24細(xì)胞TRPM8蛋白的表達(dá)及分布。利用鈣成像技術(shù)檢測(cè)T24細(xì)胞中TRPM8通道在低溫刺激下對(duì)鈣離子(Ca2+)的調(diào)控功能。
　　 結(jié)論:人膀胱癌細(xì)胞系T24細(xì)胞表達(dá)具有活性功能的TRPM8通道,可以介導(dǎo)Ca2+通透,且TRPM8蛋白在T24細(xì)胞的細(xì)胞核外細(xì)胞器表達(dá),分布于胞膜和胞漿。
　　 第二章 薄荷醇抑制人膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞增殖的研究

6、　　 目的:探討TRPM8通道及薄荷醇對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞增殖的影響
　　 方法:利用基因調(diào)控技術(shù)構(gòu)建pcDNA3-TRPM8表達(dá)型質(zhì)粒和siRNA-TRPM8干擾單體,調(diào)控T24細(xì)胞中TRPM8的表達(dá),并使用CCK-8檢測(cè)觀察,在TRPM8蛋白表達(dá)變化時(shí),T24細(xì)胞的增殖情況。同時(shí)使用TRPM8通道的激活劑-薄荷醇干預(yù),觀察T24細(xì)胞的增殖情況。進(jìn)一步使用薄荷醇和siRNA-TRPM8單體共同干預(yù)T24細(xì)胞,CCK-8檢測(cè)觀

7、察T24細(xì)胞的增殖情況,以了解TRPM8通道的增殖活性。統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)均(x)±s表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)采用單因素方差分析(one-way ANOVA),且以p<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:對(duì)于人膀胱癌T24細(xì)胞,TRPM8蛋白的表達(dá)變化不影響其生長(zhǎng)增殖,但TRPM8通道的激活劑一薄荷醇,可以呈劑量依賴性抑制T24細(xì)胞的生長(zhǎng),但該種效應(yīng)需要TRPM8通道參與。
　　 第三章 薄荷醇抑制人膀胱癌T24細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制的研究

8、>　　 目的:探討薄荷醇抑制人膀胱癌T24細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制
　　 方法:利用流式細(xì)胞學(xué)細(xì)胞篩選法,分別使用PI單染和Annexin V-FITC/PI雙染觀察不同濃度薄荷醇干預(yù)下,T24細(xì)胞的各細(xì)胞周期細(xì)胞比例及凋亡和死亡細(xì)胞比例。進(jìn)一步使用鈣成像技術(shù),檢測(cè)不同濃度薄荷醇對(duì)T24細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的影響。并使用JC-1熒光探針法和DCFH-DA熒光探針法在共聚焦顯微鏡下分別觀察不同濃度薄荷醇對(duì)T24細(xì)胞中線粒體膜電位和細(xì)胞內(nèi)活

9、性氧(ROS)的影響。再進(jìn)一步使用N-乙酰半胱氨酸(NAC)和薄荷醇共同干預(yù),CCK-8檢測(cè)觀察其對(duì)T24細(xì)胞增殖的影響。最后使用western蛋白印跡法檢測(cè)ROS生長(zhǎng)相關(guān)通路信號(hào)蛋白的表達(dá)變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)均以(x)±s表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)采用單因素方差分析(one-way ANOVA),且以p<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:薄荷醇通過增加人膀胱癌T24細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i,導(dǎo)致線粒體去極化或非線粒體通路激活,而誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS