丹參酮抗痤瘡機(jī)制研究及薄荷醇增強(qiáng)其作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　建立一種基于kligman痤瘡模型的痤瘡復(fù)合動(dòng)物模型，以期獲得更接近臨床癥狀的痤瘡模型；觀察外用丹參酮對(duì)兔耳痤瘡模型的影響及研究其抗痤瘡機(jī)制；探討薄荷醇增強(qiáng)其作用的機(jī)制。
　　方法：
　　1.痤瘡復(fù)合模型的建立
　　在家兔耳內(nèi)側(cè)涂抹煤焦油，并在涂藥處接種痤瘡丙酸桿菌（P.acne）菌液。2w后，測(cè)量表面微循環(huán)，檢測(cè)耳增厚程度，并進(jìn)行病理組織檢查。采用Elisa法檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素-1α（IL-1α）

2、、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和二氫睪酮（DHT）濃度。
　　2.丹參酮治療機(jī)制研究
　　新西蘭兔48只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組（克林霉素凝膠）及丹參酮高、中、低劑量組、丹參酮+薄荷醇組、乳膏基質(zhì)組，模型制備成功后，在造模部位2cm×2cm范圍涂抹對(duì)應(yīng)藥物0.5g，每日1次，給藥2w后，測(cè)定局部血管微循環(huán)、耳增厚程度、血清中IL-1α、IL-6和DHT含量，分別測(cè)定丹參酮、克林霉素及薄荷醇的最低抑菌濃度（M

3、IC）。
　　3.薄荷醇在痤瘡治療中的應(yīng)用及其促透機(jī)制研究
　　3.1薄荷醇促透實(shí)驗(yàn)研究
　　采用自制體外透皮實(shí)驗(yàn)裝置，采用大鼠皮膚作為滲透屏障，模型藥物為乙酰氨基酚，計(jì)算出其穩(wěn)態(tài)流量及滲透系數(shù)，探討薄荷醇的促透效果及硝苯地平對(duì)其的干預(yù)作用。
　　3.2透射電鏡觀察薄荷醇對(duì)皮膚結(jié)構(gòu)的影響
　　大鼠皮膚仔細(xì)用剃須刀脫毛，涂抹薄荷醇溶液8h，取用藥部位皮膚，4℃下使用2.5％戊二醛中固定1h，采用1%鋨酸固定后

4、固定2h，PBS中清洗，脫水，浸透包埋，超薄切片，透射電鏡觀察皮膚表面結(jié)構(gòu)及角質(zhì)層間隙的變化。
　　3.3觀察薄荷醇對(duì)跨膜電阻抗（TEER）的影響
　　體外培養(yǎng)KC，接種1×104 KC至孔徑為0.4μM的12孔Transwell當(dāng)中，小室內(nèi)加入培養(yǎng)液0.4mL，小室外加入培養(yǎng)液2mL，培養(yǎng)細(xì)胞5d至細(xì)胞完全融合，加入含25、50、100、200μM薄荷醇及硝苯地平的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，觀察其TEER的變化及對(duì)單層細(xì)胞間緊密程度

5、的影響。加入200μM薄荷醇觀察其0.5h、1h、2h、4h、6h、12h、24h電阻抗隨時(shí)間的變化。
　　3.4薄荷醇對(duì)單層細(xì)胞異硫氰酸酯熒光素結(jié)合白蛋白（FITC-BSA）滲透量的影響
　　接種1×104 KC細(xì)胞至孔徑為0.4μM的12孔Transwell當(dāng)中，培養(yǎng)細(xì)胞5d至細(xì)胞完全融合，用PBS洗兩次去除培養(yǎng)基，內(nèi)室換為含0.05mg?mL-1 FITC-BSA的培養(yǎng)基200μl，在外室培養(yǎng)基中加入含25、50、10

6、0、200μM薄荷醇及硝苯地平的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，收集內(nèi)室液體200μL，避光。采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定收集液體在（490nm激發(fā)波長）520nm波長處熒光吸光度值。
　　3.5利用免疫熒光及western-blot研究薄荷醇對(duì)黏附連接（adhesion junction）蛋白E-鈣粘素（E-cadherin）及β-連環(huán)蛋白（β-catenin）分布和表達(dá)的影響。
　　接種KC于預(yù)置玻片的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁后12h換用無血清DM

7、EM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，用空白培養(yǎng)基和分別含有200μM薄荷醇、100μM硝苯地平+200μM薄荷醇、100μM硝苯地平培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞4h，免疫熒光測(cè)定E-cadherin含量。
　　接種1×104細(xì)胞于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁后12h時(shí)換用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h時(shí)，用空白培養(yǎng)基和分別含有200μM薄荷醇、100μM硝苯地平+200μM薄荷醇、100μM硝苯地平培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞4h，提取總蛋白，western-blot法測(cè)定E-ca

8、dherin及β-catenin表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　1.痤瘡復(fù)合模型的建立
　　復(fù)合模型組較Kligman組IL-α沒有差異性（P＞0.05），IL-6增加顯著(P＜0.01)），DHT有一定的上升(P＜0.05)。復(fù)合模型對(duì)于Kligman組兔耳腫脹程度可見一個(gè)顯著的增加(P<0.01)。復(fù)合模型組較Kligman血液微循環(huán)具有一定的降低(P<0.05)。病理組織觀察顯示復(fù)合模型組表皮角化過度增厚，顆粒層、

9、棘層肥厚，毛囊口充滿角化物質(zhì)，毛囊口由于過多的內(nèi)容物而膨脹突出，毛囊漏斗部破裂，可見炎癥細(xì)胞浸潤。痤瘡復(fù)合模型相對(duì)于Kligman模型表現(xiàn)出更嚴(yán)重的痤瘡反應(yīng)。
　　2.丹參酮治療機(jī)制研究
　　模型組家兔耳片重為（71.7±9.8）mg，丹參酮高、中、低劑量組、3%丹參酮+1%薄荷醇組和陽性藥物組相對(duì)于模型組均有顯著性降低(P<0.01)，分別為（80.0±14.1） g、（88.3±7.5）g、（105.0±10.5）g、（

10、86.7±23.4）g和（71.7±9.8）g。模型組家兔血清IL-1α為（90.22±15.00）ng·L-1，丹參酮高、中劑量組、3%丹參酮+1%薄荷醇組和陽性藥物組（46.89±8.07）ng·L-1血清中IL-1α均有非常顯著性降低(P<0.01)，分別為（52.44±14.09）ng·L-1、（68.56±10.02）ng·L-1和（50.22±11.09）ng·L-1。模型組家兔血清IL-6為（135.88±11.28）ng

11、·L-1，丹參酮高、中、低劑量組、丹參酮+薄荷醇組和陽性藥物組血清中IL-6均有顯著下降(P<0.01)，分別為（74.00±12.0）ng·L-1、（78.58±19.57）ng·L-1、（85.04±17.27）ng·L-1、（72.33±10.68）ng·L-1和（81.08±12.62） ng·L-1。與模型組（41.17±5.34）比較，丹參酮高（84.17±5.60）、中（71.83±5.23）、低劑量組（61.33±2.5

12、8）和陽性藥物組（30.22±4.77）均能顯著提高兔耳涂藥部位的微血管灌注量(P<0.01),與模型組（41.45±4.71）比較，丹參酮高（23.17±4.38）ng·L-1、中（24.65±2.48）ng·L-1劑量組、丹參酮3%+薄荷醇1%組（23.72±2.79）ng·L-1均能使血清中DHT含量非常顯著性地降低(P<0.01)；陽性藥物（30.22±4.77）ng·L-1降低程度低于丹參酮治療組，能一般程度降低血清中DHT(

13、P<0.05)?？肆置顾氐淖畹鸵志鷿舛萂IC為31.25 mg·L-1,丹參酮的MIC為195.31 mg·L-1，薄荷醇顯示出微弱的抑制作用MIC為6250.0mg·L-1。
　　3.薄荷醇促透機(jī)制研究
　　3.1薄荷醇體外促透效果
　　相對(duì)正常組，在增加薄荷醇后能夠顯著提高模型藥物對(duì)乙酰氨基酚的透皮吸收效果，累計(jì)滲透量、穩(wěn)態(tài)流量及滲透系數(shù)均能顯著提高（P＜0.01），但是在增加硝苯地平后，相對(duì)于薄荷醇組累計(jì)滲透量、

14、穩(wěn)態(tài)流量及滲透系數(shù)均發(fā)生一定程度的下降（P＜0.01），但仍高于正常組各指標(biāo)（P＜0.01）,顯示出硝苯地平對(duì)薄荷醇促透效果具有一定的阻滯作用。
　　3.2透射電鏡觀察薄荷醇對(duì)皮膚結(jié)構(gòu)的影響
　　正常角質(zhì)層呈帶狀分布，有15-20層細(xì)胞組成，層與層間較密集，角質(zhì)層細(xì)胞間隙中可見角質(zhì)層脂質(zhì)為連續(xù)或間斷不連續(xù)的電子透明帶，呈均勻、交替相間規(guī)則的板層狀排列，高倍數(shù)（1000000×）下可見清晰的黏附連接。薄荷醇組與正常組相比，黏附

15、連接之間的距離增大，細(xì)胞間的緊密程度下降。脂質(zhì)正常的板層狀膜狀結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)明顯增厚的、紊亂排列的、中等致密的凝絮塊狀結(jié)構(gòu)。
　　3.3薄荷醇對(duì)跨膜電阻抗的影響
　　電阻抗實(shí)驗(yàn)顯示,薄荷醇引起KC的TEER濃度依賴性下降，硝苯地平能提高200μM組電阻值。薄荷醇引起KC的TEER時(shí)間依賴性上升，隨著時(shí)間的延長，電阻緩慢恢復(fù)正常水平。
　　3.4薄荷醇對(duì)單層細(xì)胞FITC-BSA滲透量的影響
　　FITC-BSA漏出

16、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，薄荷醇可增加KC的通透性，濃度越高對(duì)其通透性作用越強(qiáng)，呈濃度依賴性。使用硝苯地平可降低200μM薄荷醇組的FITC-BSA滲透量（P＜0.05），與25μM薄荷醇組相當(dāng)（P＞0.05），但仍高于正常組（P＜0.05）。3.5利用免疫熒光及western-blot分別研究薄荷醇對(duì)黏附連接（adhesion junction）蛋白E-cadherin及β-catenin分布和表達(dá)的影響。
　　western-blot實(shí)驗(yàn)

17、顯示薄荷醇對(duì)于β-catenin的表達(dá)與正常組比較沒有差異性，硝苯地平與正常組比較沒有差異性。使用薄荷醇后，E-cadherin表達(dá)水平下降，而硝苯地平對(duì)于薄荷醇導(dǎo)致的E-cadherin水平下降沒有阻滯作用，免疫熒光和western-blot產(chǎn)生相同的結(jié)果。
　　結(jié)論:
　　基于Kligman兔耳模型聯(lián)合注射P.acne能建立更符合臨床發(fā)病癥狀的痤瘡動(dòng)物模型，其更接近于并發(fā)炎癥的重癥痤瘡。丹參酮治療痤瘡機(jī)制主要集中在：①抑