炎癥免疫因素誘發(fā)動脈粥樣硬化過程中關鍵基因篩選、鑒定及三七總皂苷調(diào)控作用.pdf

1、背景與目的： 心血管疾病每年導致的死亡人數(shù)位列各類疾病之首，尤其是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)及其并發(fā)癥不僅占有很大比例，也是大多數(shù)心血管疾病的共同病理基礎和關鍵發(fā)病環(huán)節(jié)。既往研究認為血清總膽固醇增高等是致AS的主要因素，但新近臨床流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)大約50％的AS患者的血脂水平是正常的。全球在努力控制血脂水平的情況下，AS及其他心血管疾病的發(fā)病率仍逐年增加，提示有其他重要致病因素存在。最近大規(guī)模的臨床研究

2、發(fā)現(xiàn)，慢性支氣管炎、前列腺炎、牙齦炎等慢性炎癥性疾病患者AS發(fā)病率顯著高于正常人群，其缺血性腦中風的發(fā)生率也顯著高于非感染/炎癥患者(48％vs24％)。另一方面，心血管疾病患者單核細胞趨化蛋白(monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1)及C反應蛋白(C-reactiveprotein，CRP)等炎癥因子水平顯著升高，并與心血管疾病(即使在血脂水平“正常”的人)發(fā)病率也呈顯著正相關，這些強烈提示炎癥免

3、疫因素在AS形成中可能具有重要作用。 中醫(yī)學根據(jù)AS受累部位、病理特征等，認為該病屬于“瘀血”范疇，在辨證上多屬氣虛血瘀，治則上多選用活血化瘀等藥物。三七總皂苷(totalsaponinsofPanaxnotoginseng，PNS)是三七的主要有效成分，研究證明其可降血脂，并對多種心血管疾病尤其是AS有良好的防治作用。 運用高通量基因表達譜芯片對藥物治療前后基因表達差異分析，是研究中藥多環(huán)節(jié)、多靶點治療的有效手段之一。

4、為進一步明確炎癥免疫因素誘發(fā)AS的信號轉(zhuǎn)導機制以及PNS作用的具體分子靶點，我們用高脂飲食喂飼大鼠的同時疊加酵母多糖(zymosan，Zym)成功建立炎癥免疫因素誘發(fā)SD大鼠AS模型，利用AS功能分類基因芯片收集PNS作用相關信號轉(zhuǎn)導信息，希望相對明確PNS在防治炎癥免疫因素誘發(fā)AS過程中所涉及的關鍵調(diào)節(jié)基因、蛋白及其功能，從而在一定程度上揭示AS發(fā)病機制以及PNS調(diào)節(jié)機制，也為從中藥中篩選控制AS或炎癥免疫性疾病新藥提供可靠理論依據(jù)。

5、 方法： 1.實驗分為對照組、模型組和治療組3組，分別腹腔注射給予無菌醫(yī)用液體石蠟、酵母多糖(Zym,20mg/kg，1次/3天)、Zym(20mg/kg，1次/3天)+PNS(100mg/kg，1次/天)。所有大鼠均喂食含3％膽固醇的高脂飼料9周。最后一次給藥后3天禁食12小時，腹腔注入1％戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉，從左心室取血，測定血脂水平和血液粘度；解剖后取下整段主動脈，置于液氮保存?zhèn)溆谩?2.血清

6、總膽固醇和甘油三酯水平測定采用酶法，全血粘度(高切和低切)以及血漿比粘度測定采用旋轉(zhuǎn)法，在全自動血液流變分析儀上進行。電鏡分析。PNS對病變組織改變作用。 3.第二部分實驗分對照組、模型組和治療組3組(對照組喂食正常飼料，其余同第一部分)，采用動脈粥樣硬化及信號轉(zhuǎn)導通路兩種功能分類基因芯片檢測免疫炎癥因素刺激9周后3組AS病變相關基因表達差異，應用實時定量PCR及Westernblot對芯片結(jié)果進行驗證。 4.根據(jù)上述結(jié)

7、果線索，整合素是PNs調(diào)節(jié)的關鍵環(huán)節(jié)，因此選用LPS、LPS+PNS10μg組、LPS+PNS30μg組、LPS+PNS100μg分別作用于小鼠腹腔巨噬細胞，采用免疫組化方法、Westernblot技術(shù)檢測P397FAK表達水平。 結(jié)果： 1.Zym組TC、TG水平顯著增加，分別是對照組的2.62、5.56倍(P＜0.01)，經(jīng)PNS治療后，TC、TG水平比起對照組明顯降低。另外，Zym組刺激后血粘度也顯著增加，PNS對

8、其有上述類似效應。電鏡結(jié)果顯示高脂對照組內(nèi)皮損傷較輕，僅有少量內(nèi)皮細胞脫落，內(nèi)皮下未見泡沫化的單核細胞，Zym組動脈壁內(nèi)皮細胞明顯破壞，在動脈壁還可見穿過彈力板游走至內(nèi)膜下的平滑肌細胞及血源性吞噬脂質(zhì)的單核細胞，單核細胞、平滑肌細胞游走至內(nèi)皮下是AS病變的特征性超微結(jié)構(gòu)的改變。 2.動脈粥樣硬化及信號轉(zhuǎn)導通路兩種功能功能分類基因芯片結(jié)果顯示：在Zym組，炎癥相關因子MMP2、MMP9、MMP7、IL-18、IL-1b表達顯著上調(diào)

9、，而PNS顯著降低這些基因的表達；另外，一些與血脂調(diào)節(jié)及血管活性相關的基因如ANF、iNOS、在經(jīng)PNS治療后顯著上調(diào)，而Edn、凝固因子Ⅲ(coagulationfactorⅢ，TF)則下調(diào)。在本實驗中，PNS對整合素家族的調(diào)節(jié)作用尤為明顯，與對照組相比，Zym組90％以上整合素家族成員表達上調(diào)；而與Zym相比，PNS組90％以上整合素家族表達下調(diào)。之后挑選ANF、iNOS、IκBa、MMP7、COX-2基因做實時定量PCR分析，結(jié)果

10、與芯片結(jié)果一致。Westernblot結(jié)果進一步證實Zym刺激引起大鼠NFκB蛋白表達升高，IκBα蛋白表達降低；與Zym組相比，PNS則明顯抑制NFκB蛋白表達，促進IκBα蛋白表達。 3.PNS顯著降低LPS誘導的P397FAK蛋白表達，免疫組化顯示FAK活化主要在胞漿，對照組少量表達P397FAK，LPS組P397FAK表達明顯高于對照組。PNS各治療組P397FAK表達量明顯減少。 結(jié)論： 1.我們在成功

11、建立大鼠炎性AS模型基礎上，觀察到炎癥刺激可加重脂代謝紊亂，明顯升高血液粘度，損傷動脈血管內(nèi)皮細胞，加速AS病變。PNS可通過改善脂代謝紊亂及降低血液粘度等多條途徑預防AS。 2.炎癥可明顯增加動脈壁組織MMP2、7、9，VCAM-1，ICAM-1，Edn2、3表達。而PNS可顯著抑制這些基因表達，其機制除了抑制NFκB表達及核轉(zhuǎn)移外，還可以通過增加IκB的表達實現(xiàn)，而后者表現(xiàn)出一定的類糖皮質(zhì)激素效應。 3.炎癥刺激對整

12、合素家族表達上調(diào)作用尤為明顯，由于整合素胞內(nèi)效應分子為FAK，而FAK是多種信號調(diào)節(jié)通路上游調(diào)控分子(包括NFκB等)，因此推測炎癥免疫因素誘發(fā)AS重要途徑是通過增加整合素表達激活FAK實現(xiàn)，相反PNS可顯著抑制整合素的表達，以至抑制FAK第397位磷酸化，此途徑可能與增加IκB的表達途徑一起共同干預AS病變過程中的炎癥、粘附反應與增殖反應。 4.PNS血管活性調(diào)節(jié)作用在防治AS發(fā)病過程中也發(fā)揮重要作用，PNS可顯著增加iNOS