肝癌新標志物人宮頸癌基因的克隆、原核表達及多克隆抗體的制備.pdf

1、 華中科技大學同濟醫(yī)學院 碩士學位論文肝癌新標志物人宮頸癌基因的克隆、原核表達及多克隆抗體的制備碩士研究生：夏劍波導 師：楊東亮教授華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院l 臨床免疫研究室中文摘要目的本課題旨在將一個新的肝癌標志物人宮頸癌基因( h u m a nc e r v i c a lc a n c e r o n c o g e n e ，H C C R ) 進行克隆、原核表達以及制備多克隆抗體，為進一步研究其作為肝癌診斷標志的

2、可行性及臨床意義奠定基礎。方法 應用R T - P C R 技術，從人肝癌細胞系H e p G 2 細胞中擴增得到H C C R ．1 1 6 7 - 3 6 0 c D N A ，再將其克隆到原核表達載體p R S E T - B 內(nèi)，用I P T G 誘導在大腸桿菌B L 2 1 ( D E 3 ) p l y s S 中表達。利用鎳離子親合層析純化融合蛋白，并通過E L i S A 和w e s t e r nb l o t 方法

3、檢測重組蛋白的抗原性。將純化的重組蛋白免疫B A L B ／c 小鼠制各多克隆抗體，并采用E L I S A 、W e s t e r n b l o t 和免疫組化的方法檢測抗體的靈敏度和特異性。結果1 ．應用R T - P C R 技術，從人肝癌細胞系H e p G 2 細胞中擴增得到大小約為6 0 0 b p的H C C R ．1 1 6 7 - 3 6 0 c D N A 片段。2 ．通過P C R 鑒定、酶切鑒定和D N A

4、測序表明：成功地構建了表達截短型H C C R ．1 ( 1 6 7 - - 3 6 0 a a ) 蛋白的原核表達質(zhì)粒p R S E T - B ．H C C R ．1 。3 ．通過I P T G 誘導，重組H C C R - 1 蛋白在表達菌B L 2 1 ( D E 3 ) p l y s S 內(nèi)得以高效表達，觀察到目的蛋白是以包涵體的形式存在。通過鎳離子親合層析純化和W e s t e r n b l o t 分析，得到了分子量