小鼠羊膜干細(xì)胞改善APPswe-PS1△E9雙轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能的研究.pdf

1、目的:
　　分離并培養(yǎng)C57BL/6J-TgN(chickenβ-actin-EGFP) ZLFILAS小鼠羊膜干細(xì)胞(amnion-derived stem cells，ADSCs)，并探索其特性。ADSCs具有多潛能分化和自我更新的能力，并能分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子營(yíng)養(yǎng)支持神經(jīng)元存活。通過(guò)移植小鼠ADSCs至APPswe/PS1△E9(PAP)雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠海馬內(nèi)，檢測(cè)PAP小鼠認(rèn)知功能，明確小鼠ADSCs對(duì)PAP小鼠認(rèn)知功能的影響

2、并進(jìn)行初步的機(jī)制探討研究，為干細(xì)胞移植治療探尋新的細(xì)胞來(lái)源，并對(duì)ADSCs治療AD的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法:
　　無(wú)菌條件下機(jī)械分離C57BL/6J-TgN(chickenβ-actin-EGFP) ZLFILAS小鼠羊膜，并采用0.25％胰蛋白酶-EDTA的消化，應(yīng)用高糖-DMEM培養(yǎng)基（添加10μg/L人表皮生長(zhǎng)因子）培養(yǎng)。取2-4代小鼠ADSCs，免疫熒光方法檢測(cè)干細(xì)胞表面標(biāo)記物:性別決定區(qū)Y框蛋白(s

3、ex determining region Y box2，SOX-2)、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor，OCT-4)、間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin，胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物階段特異性胚胎表面標(biāo)記物-3(stagespecific embryonic antigen-3，SSEA-3)、階段特異性胚胎表面標(biāo)記物-4(stagespecific embryonic antigen

4、-4，SSEA-4)、神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（glial fibrillary acidic protein，GFAP），還可表達(dá)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF);細(xì)胞流式術(shù)方法檢測(cè)ADSCs表面表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD29、CD44、CD105、CD73、CD45和CD11b。

5、r>　　免疫印跡方法檢測(cè)6月齡野生型C57BL/6J和PAP小鼠腦組織海馬內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)水平。PCR方法鑒定APPswe/PS1△E9小鼠基因型。采用腦立體定位技術(shù)，移植ADSCs至6月齡PAP小鼠海馬(PAP-ADSC)內(nèi)，同時(shí)對(duì)照組注射同等劑量的PBS(PAP-PBS)，野生型組注射相等劑量ADSCs(WT-ADSC)和PBS(WT-PBS)。細(xì)胞移植4周后，通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)檢測(cè)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力

6、及自主活動(dòng)情況。移植6周后，通過(guò)免疫印記方法檢測(cè)BDNF、突觸素(synaptophysin，Syn)、APP和P-Tau(Thr231)/Tau-5蛋白水平，ELISA檢測(cè)腦組織海馬內(nèi)Aβ40和Aβ42含量。免疫熒光方法檢測(cè)腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP、小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物離子型鈣結(jié)合受體分子-1(ionized calcium binding adaptor molecle-1，Iba1)激活情況。硫黃素-S熒光染色和6E10染色觀察

7、腦內(nèi)老年斑沉積情況。免疫組化檢測(cè)小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白-2改變情況。
　　結(jié)果:
　　分離培養(yǎng)2-4代小鼠ADSCs，經(jīng)過(guò)細(xì)胞免疫熒光和細(xì)胞流式術(shù)方法鑒定，其中細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，C57BL/6J-TgN(chickenβ-actin-EGFP) ZLFILAS小鼠羊膜細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物SOX-2、OCT-4、間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin，胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物SSEA-3、SSEA-4、神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nes

8、tin和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP，還可表達(dá)BDNF和NGF;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面抗原，小鼠羊膜干細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD29、CD44、CD105、CD73和CD45，其中CD29和CD44表達(dá)量在90％以上，少量表達(dá)CD11b。
　　免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，與6月齡野生型C57BL/6J相比，同月齡PAP小鼠腦組織海馬內(nèi)BDNF水平明顯減少。移植ADSCs至6月齡PAP小鼠海馬內(nèi)，移植2周后通過(guò)免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)ADSC

9、s在腦內(nèi)可存活。細(xì)胞移植4周后，通過(guò)Morris水迷宮檢測(cè)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果顯示:在隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，與PAP-PBS小鼠相比，PAP-ADSC小鼠尋找平臺(tái)所用的潛伏期明顯縮短;在空間探索實(shí)驗(yàn)中，PAP-ADSC小鼠穿過(guò)平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)明顯增多;曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，PAP-ADSCs小鼠表現(xiàn)異常自主活動(dòng)明顯減少。細(xì)胞移植6周后，免疫印跡結(jié)果顯示，與PAP-PBS小鼠相比，PAP-ADSCs小鼠海馬內(nèi)BDNF和Syn水平增加，而兩組間AP

10、P和P-Tau(Thr231)/Tau-5水平?jīng)]有明顯變化。ELISA檢測(cè)Aβ40、Aβ42沒(méi)有明顯差異。免疫熒光檢測(cè)PAP-ADSC小鼠腦組織海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活減少。6E10染色和硫黃素-S熒光染色結(jié)果顯示腦內(nèi)老年斑沉積沒(méi)有明顯變化。免疫組化檢測(cè)PAP-ADSCs與PAP-PBS小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白-2沒(méi)有顯著變化。
　　結(jié)論:
　　ADSCs可表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等干細(xì)胞標(biāo)