APPswe-PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠成年海馬神經(jīng)發(fā)生及微環(huán)境的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性變性疾病，臨床癥狀可表現(xiàn)為進(jìn)行性的認(rèn)知損傷、注意力下降、記憶障礙、空間記憶缺失以及情緒失衡，生活自理能力喪失，嚴(yán)重危害著老年人的身體健康和生活質(zhì)量。目前認(rèn)為，AD是由遺傳學(xué)因素、環(huán)境因素和代謝因素等多種因素，共同作用所引起的一種病理過(guò)程。其特征性病理改變?yōu)榧?xì)胞外的老年斑(senile plaques，SP)沉積和神經(jīng)元細(xì)胞軸突內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)，兩者分別

2、由β淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide，Ap)和過(guò)度磷酸化的Tau蛋白組成。大量的研究證實(shí)，神經(jīng)末梢的Ap異常聚集可導(dǎo)致突觸損傷和神經(jīng)元的退行性病變。海馬作為與學(xué)習(xí)記憶、空間認(rèn)知等高級(jí)功能密切關(guān)聯(lián)的重要腦區(qū)，也是AD病程中受累及的主要腦區(qū)之一。對(duì)海馬病變的病理機(jī)制的深入研究必將有助于我們?nèi)嬲J(rèn)識(shí)AD并為治療提供有力線索。 近年來(lái)，成年神經(jīng)發(fā)生已在鳥(niǎo)類、爬行類、嚙齒類、靈長(zhǎng)類包括人類的不同種屬間得到證實(shí)。一般認(rèn)為，成年

3、哺乳動(dòng)物腦內(nèi)的神經(jīng)發(fā)生限子側(cè)腦室的室下區(qū)和海馬齒回(dentate gyrus，DG)的顆粒下區(qū)(subgranularzone，SGZ)。SGZ新生的神經(jīng)元能遷移到顆粒細(xì)胞層并分化為成熟的顆粒神經(jīng)元。海馬是公認(rèn)的與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的結(jié)構(gòu)，而DG是海馬回路的重要通路，與海馬相關(guān)的學(xué)習(xí)任務(wù)訓(xùn)練能增加成年大鼠新生神經(jīng)元數(shù)量。以學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知功能障礙等為特征的AD病變中，成年海馬神經(jīng)發(fā)生是否異常以及其機(jī)制研究，這是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。以往在不同AD

4、病人和動(dòng)物模型的研究中，觀察到的海馬成年神經(jīng)發(fā)生出現(xiàn)增強(qiáng)或減弱的兩種截然相反的報(bào)道。我們認(rèn)為這種不一致性主要是由于AD患病人群的種群差異，家族性早發(fā)性AD與散發(fā)性AD的相關(guān)基因的表達(dá)差異，以及動(dòng)物模型的遺傳背景、動(dòng)物品系等差異。 目前對(duì)成年海馬神經(jīng)發(fā)生的調(diào)控機(jī)制的研究表明，局部微環(huán)境或者壁龕(Niche)控制神經(jīng)發(fā)生。對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)微環(huán)境的認(rèn)識(shí)，在理解NSCs如何增殖、分化，最終整合

5、到成熟的神經(jīng)環(huán)路中有重要提示。從分子機(jī)制的角度看，有幾個(gè)重要的微環(huán)境成分被提出。其中骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)和拮抗蛋白Noggin，已被證實(shí)是NSCs微環(huán)境的關(guān)鍵組成成分。BMP4是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p蛋白家族中的一員，BMPs和它們的調(diào)節(jié)基因與早期胚胎發(fā)生相關(guān)，在細(xì)胞分化中起重要的的定向誘導(dǎo)作用。BMP4和noggin在出生后和成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，提示BMP4和Noggin是NSCs正常

6、分化所需微環(huán)境的關(guān)鍵成分，并可能在成年神經(jīng)發(fā)生中也發(fā)揮重要的調(diào)控作用。已有的研究證實(shí)，Noggin與BMPs共同調(diào)控成年腦內(nèi)室下區(qū)NSCs的分化。室下區(qū)室管膜細(xì)胞表達(dá)Noggin，拮抗BMPs信號(hào)作用而促進(jìn)神經(jīng)元產(chǎn)生。由此推測(cè)，室管膜通過(guò)產(chǎn)生Noggin來(lái)封閉內(nèi)源性BMPs信號(hào)，為鄰近的室下區(qū)干細(xì)胞提供有利于神經(jīng)發(fā)生的微環(huán)境。Noggin和BMP4在出生后大鼠海馬SGZ增殖區(qū)有表達(dá)。對(duì)于APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠，成年海馬齒狀

7、回NSCs的增殖與分化是否正常，神經(jīng)發(fā)生異常與組織病變有無(wú)關(guān)聯(lián)，微環(huán)境中有哪些重要信號(hào)分子參與成年海馬神經(jīng)發(fā)生，目前尚缺乏相關(guān)報(bào)道。另外，老年斑內(nèi)Aβ1-42蛋白與活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞同樣作為AD腦內(nèi)微環(huán)境的重要組分之一，是否也參與了海馬NSCs的“命運(yùn)”轉(zhuǎn)歸的調(diào)控？機(jī)制怎樣？我們推測(cè)，BMP4/Noggin、Ap、星形膠質(zhì)細(xì)胞在分子水平與細(xì)胞水平參與AD海馬NSCs的異常成年神經(jīng)發(fā)生的調(diào)節(jié)。 本研究主要的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 1.

8、APPswe/PS1dE9小鼠成年海馬神經(jīng)發(fā)生水平下降。 運(yùn)用BrdU標(biāo)記方法來(lái)觀察APPswe/PSldE9小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)發(fā)生情況，并進(jìn)一步觀察APPswe/PS1dE9小鼠Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶行為及其特征性腦組織病理學(xué)變化。探討APPswe/PS1dE9小鼠成年神經(jīng)發(fā)生異常及其病理學(xué)、行為學(xué)的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示：APPswe/PS1dE9小鼠在成年及老年期的海馬神經(jīng)發(fā)生水平下降。能夠模擬AD主要病理特征

9、的Aβ沉積、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的老年斑結(jié)構(gòu)，但無(wú)顯著神經(jīng)元丟失。老年期存在空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙。結(jié)果提示，APPswe/PS1dE9小鼠成年海馬神經(jīng)發(fā)生下降與海馬區(qū)Aβ淀粉樣斑塊的不斷聚集存在顯著的相關(guān)性。Ap淀粉樣蛋白可能參與了AD成年神經(jīng)發(fā)生的異常。 2.BMP4、Noggin分子參與調(diào)節(jié)APPswe/PS1dE9小鼠成年海馬神經(jīng)發(fā)生。 采用原位雜交與免疫組化方法，觀察APPswe/PS1dE9小鼠海馬區(qū)BMP4和No

10、ggin在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況，并且運(yùn)用側(cè)腦室注射Noggin蛋白來(lái)進(jìn)一步觀察海馬區(qū)NSCs的增殖與分化的改變。探討B(tài)MP4和Noggin在APPswe/ PS1dE9小鼠海馬區(qū)的表達(dá)及其與成年海馬神經(jīng)發(fā)生的潛在聯(lián)系。結(jié)果顯示：BMP4 mRNA和蛋白質(zhì)的高表達(dá)，Noggin的mRNA和蛋白質(zhì)的低表達(dá)，都具有年齡依賴性，且二者之間具有顯著的相關(guān)性。首次發(fā)現(xiàn)APPswe/PSldE9小鼠海馬BMP4的高表達(dá)與海馬齒狀回NSCs增殖

11、能力的下降具有正相關(guān)性。Noggin的低表達(dá)與海馬齒狀回NSCs增殖能力的下降具有負(fù)相關(guān)性。并且運(yùn)用Noggin嵌合蛋白拮抗BMP4作用，可促進(jìn)APPswe/PSldE9小鼠海馬NSCs的增殖與分化。結(jié)果提示BMP4與Noggin可能協(xié)同參與海馬神經(jīng)發(fā)生的調(diào)控。 原代分離純化小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞，添加不同濃度BMP4細(xì)胞因子，觀察BMP4對(duì)NSCs的增殖與分化的影響。結(jié)果顯示BMP4能抑制海馬NSCs增殖，抑制其向神經(jīng)元分化。進(jìn)一

12、步采用Noggin重組腺病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞，再加入BMP4細(xì)胞因子，以觀察Noggin對(duì)NSCs的增殖和分化的影響。結(jié)果顯示Noggin通過(guò)拮抗BMP4的作用，能有效促進(jìn)海馬NSCs的增殖，并促進(jìn)其向神經(jīng)元分化。 3.Aβ、星形膠質(zhì)細(xì)胞參與對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控。 成功分離原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和原代小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞，利用Transwell共培養(yǎng)體系，分別觀察Aβ、星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)NSCs的增殖與分化的影響。結(jié)果顯示

13、：在體外培養(yǎng)條件下，Aβ42蛋白和星形膠質(zhì)細(xì)胞均可有效的誘導(dǎo)NSCs的細(xì)胞遷移，顯著促進(jìn)NSCs的細(xì)胞增殖與神經(jīng)分化，但是以膠質(zhì)分化為主。結(jié)果提示Aβ、星形膠質(zhì)細(xì)胞可能在AD某一病程階段，發(fā)揮正性作用，參與神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化的調(diào)節(jié)。 綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)APPswe/PS1dE9小鼠的成年海馬神經(jīng)發(fā)生下降，這種異常發(fā)生狀態(tài)與BMP4、Noggin在成年海馬區(qū)的異常表達(dá)以及協(xié)同作用機(jī)制有密切關(guān)聯(lián)。并經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)老化聚集的A