APP-PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的鑒定及BMP4與其海馬細(xì)胞增殖的關(guān)系.pdf

1、近年來(lái)，成年神經(jīng)發(fā)生已在鳥類、爬行類、嚙齒類、靈長(zhǎng)類包括人類的不同種屬間得到證實(shí)。一般認(rèn)為，成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)的神經(jīng)發(fā)生限于側(cè)腦室的室下區(qū)和海馬齒回(dentategyrus，DG)的顆粒下區(qū)(subgranularzone，SGZ)。SGZ新生的神經(jīng)元能遷移到顆粒細(xì)胞層(granulecelllayer，GCL)分化為成熟的顆粒神經(jīng)元。海馬是公認(rèn)的與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的結(jié)構(gòu)，而DG是海馬回路的重要通路。與海馬相關(guān)的學(xué)習(xí)任務(wù)訓(xùn)練能增加成年大鼠新

2、生神經(jīng)元數(shù)量，而移植神經(jīng)前體細(xì)胞能逆轉(zhuǎn)年齡相關(guān)的記憶缺陷。人類也觀察到海馬成年神經(jīng)發(fā)生，而且與海馬的可塑性改變密切相關(guān)。許多研究提示多種生長(zhǎng)因子和激素、豐富環(huán)境、多種病理狀態(tài)，比如癲癇、中風(fēng)、帕金森病等可以影響發(fā)育中的和成年嚙齒類動(dòng)物的神經(jīng)元的產(chǎn)生。對(duì)于成年海馬神經(jīng)發(fā)生的調(diào)控機(jī)制的研究顯示，局部微環(huán)境控制神經(jīng)發(fā)生，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcell，NSC)微環(huán)境的認(rèn)識(shí)在理解NSC如何增殖、分化，最終整合到成熟的神經(jīng)環(huán)路中有重要

3、提示。從分子機(jī)制的角度看，有幾個(gè)重要的微環(huán)境成分被提出。其中骨形成蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMPs)和它們的拮抗蛋白noggin，已經(jīng)被描述成神經(jīng)干細(xì)胞微環(huán)境的關(guān)鍵成分。BMP4是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β蛋白家族中的一員，BMPs和它們的調(diào)節(jié)基因與早期胚胎發(fā)生相關(guān)，在細(xì)胞分化中起重要的的定向誘導(dǎo)作用。BMP4和noggin在出生后和成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem，CNS)表達(dá)，提示BMP

4、4是NSC正常分化所需要微環(huán)境的關(guān)鍵成分。在以記憶和認(rèn)知功能障礙為特征的阿爾茨海默病(Alzheimerdisease，AD)中，海馬神經(jīng)發(fā)生是否異常，這是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。在不同的AD模型中，觀察到的海馬成年神經(jīng)發(fā)生出現(xiàn)增強(qiáng)或減弱兩種截然相反的報(bào)道。對(duì)于APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因(APP+/PS1+dtg)成年AD小鼠中，海馬的NSC增殖是否正常，BMP4對(duì)這種AD雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬的細(xì)胞增殖有何影響，目前尚缺乏相關(guān)報(bào)道。 本文在獲

5、得的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠中，通過(guò)血液基因組DNA抽提、PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)入基因組DNA中的APPswe基因鑒定其基因型、腦組織病理學(xué)分析、Morris水迷宮檢測(cè)行為學(xué)后，運(yùn)用核酸分子原位雜交(ISHH)、BrdU(bromodeoxyuridine，BrdU)標(biāo)記、免疫細(xì)胞化學(xué)等方法探討APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠成年海馬細(xì)胞增殖的改變及BMP4對(duì)其的影響。 結(jié)果 1.APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的基因型的鑒定

6、血液基因組DNA抽提，采用λDNA/HINDⅢ為Marker，電泳鑒定所獲小鼠基因組。顯示所提取6只小鼠的基因組DNA大小為20kb左右，可見明顯清晰的基因組DNA條帶，符合所需，能夠進(jìn)行PCR鑒定 PCR擴(kuò)增APPswe基因，以基因組DNA為模板，在所獲6只小鼠中均擴(kuò)增出約230bp內(nèi)參照β-actin，其中3只小鼠基因組DNA擴(kuò)增出約350bp的目的片段，與預(yù)計(jì)所擴(kuò)增APPswe基因大小一致。由于該小鼠在構(gòu)建時(shí)載體為大腦特異

7、性的PrP啟動(dòng)子同時(shí)控制PS1和APPswe基因的表達(dá)，所以擴(kuò)增出APPswe可認(rèn)為所獲后代中有3只成功轉(zhuǎn)入PS1和APPswe基因。 2.APP+/PS1+dtg小鼠腦組織病理學(xué)改變 APP+/pS1+dtg小鼠隨著年齡的增加，海馬和皮層剛果紅陽(yáng)性斑塊的數(shù)量和Aβ陽(yáng)性斑塊的數(shù)量顯著性地增加；剛果紅斑塊、Aβ沉積周圍繞以活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，但無(wú)皮層和海馬神經(jīng)元的顯著丟失。12月齡APP+/PS1+dtg小鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯

8、著下降。 3.APP+/PS1+dtg小鼠海馬BrdU標(biāo)記細(xì)胞數(shù)的變化 較同月齡的野生型(APP-/PS1-)小鼠相比，6月齡APP+/PS1+dtg小鼠海馬齒回BrdU標(biāo)記細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著變化(p＞0.05)，在9月齡、12月齡APP+/PS1+dtg小鼠，海馬齒回BrdU標(biāo)記細(xì)胞數(shù)較同月齡野生型小鼠顯著下降(p＜0.05)。 4.APP+/PS1+dtg小鼠海馬BMP4的表達(dá)及其與BrdU標(biāo)記細(xì)胞數(shù)的關(guān)系

9、 6月齡、9月齡、12月齡的APP+/PS1+dtg小鼠和同月齡的野生型(APP-/PS1-)小鼠比較，海馬齒回BMP4mRNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別增加了261.18％(P＜0.01)、142.55％(P＜0.01)及231.68％(P＜0.01)。BMP4mRNA在成年APP+/PS1+dtg小鼠海馬齒回的表達(dá)增強(qiáng)與海馬齒回NSC增殖水平的進(jìn)行性下降具有顯著的相關(guān)性。 結(jié)論 1.APP+/PS1+dtg小鼠海馬和皮層中有老年