哈維氏弧菌磷脂酶C的分離純化及性質(zhì)研究.pdf

1、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)廣泛存在于海洋環(huán)境中，屬于條件致病菌，能引起世界范圍內(nèi)的海水魚(yú)類(lèi)及其他養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。哈維氏弧菌的胞外分泌物如蛋白酶、溶血素、幾丁質(zhì)酶、脂酶和磷脂酶等毒力因子在致病過(guò)程中起到重要作用。本論文從發(fā)病鱸魚(yú)體內(nèi)分離的致病菌哈維氏弧菌SF-1的胞外產(chǎn)物中首次分離純化到一種磷脂酶C，并對(duì)其進(jìn)行了理化性質(zhì)及毒性試驗(yàn)研究。 先后采用(NH4)<,2>SO<,4>分級(jí)鹽析、

2、DEAE-Sepharose Fast F1ow陰離子交換層析、Sephadex G-100凝膠過(guò)濾、再次DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析等方法從哈維氏弧菌SF-1菌株的上清液中分離純化得到磷脂酶C。SDS-PAGE電泳顯示該磷脂酶C呈現(xiàn)單一條帶，分子量約為64kDa。通過(guò)Sephadex G-200凝膠過(guò)濾層析柱標(biāo)定的磷脂酶C的分子量為65kDa，兩者的結(jié)果一致，表明該酶是單體蛋白質(zhì)。硅膠板薄層層析方法顯

3、示純化的磷脂酶酶C和標(biāo)準(zhǔn)磷脂酶C(Clostridium·perfringens)對(duì)磷脂酰膽堿底物的水解產(chǎn)物相同，即該酶的水解特性與標(biāo)準(zhǔn)磷脂酶C相一致，表明該酶屬于磷脂酶C。 對(duì)酶進(jìn)行理化性質(zhì)的研究表明：該磷脂酶的最適作用溫度為50℃，最適反應(yīng)pH值為8.0，當(dāng)溫度超越40℃時(shí)，酶活性迅速下降，表明該酶是熱不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，在pH7.O時(shí)，酶活力比較穩(wěn)定，當(dāng)pH在8.0以上時(shí)，磷脂酶C活力急劇下降。lHunol/L的Co<'2+>

4、，ca<'2+>對(duì)酶活性有促進(jìn)作用，lmmol/L的Zn<'2+>和Mg<'2+>對(duì)酶活性有明顯抑制作用。0.1mmo1/L的SDS，EGTA，EDTA對(duì)酶活性都有抑制作用，但是PMsF對(duì)酶活性沒(méi)有明顯影響。 對(duì)磷脂酶c進(jìn)行化學(xué)修飾研究，10mmol/L的TNBS與該酶反應(yīng)后，磷脂酶的活性完全喪失，表明賴(lài)氨酸殘基是保持酶催化活性的必需基團(tuán)；EDAc修飾該酶后，酶活性有所降低，表明天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基對(duì)保持酶的催化活性有一定作

5、用；巰基乙醇與該酶反應(yīng)后，酶活性大大降低，表明該酶中存在的二硫鍵對(duì)保持酶活性和酶結(jié)構(gòu)有重要作用。 對(duì)磷脂酶C進(jìn)行細(xì)胞毒性研究顯示該酶對(duì)牙鲆鰓細(xì)胞系有明顯的細(xì)胞毒性作用。隨著磷脂酶C量的增加(0-5ug)，細(xì)胞毒性作用逐漸增強(qiáng)。細(xì)胞變圓，出現(xiàn)皺縮，凋亡小體開(kāi)始形成，隨后大部分細(xì)胞脫落，變成碎片，表明該酶在哈維氏弧菌致病作用中可能發(fā)揮重要作用。 該磷脂酶C的N末端氨基酸序列為A D V P A G T K L A，在基因庫(kù)中