細(xì)胞內(nèi)鈣-縫隙連接因子在針刺預(yù)治療改善缺血性心律失常中的作用.pdf

1、冠心病心肌缺血是世界范圍內(nèi)死亡率最高的疾病之一。而缺血性心律失常,尤其是室性纖顫是大多數(shù)病例心臟停跳而猝死的因為。針刺可以改善缺血性心律失常,本研究室最近的工作表明,電針預(yù)處理能夠抑制心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心律失常。而有關(guān)針刺預(yù)處理抗缺血性心律失常的機制,迄今無人涉足。
　　 最近幾年有關(guān)缺血預(yù)處理的機制研究也逐步轉(zhuǎn)移到縫隙連接及其連接因子方面。缺血預(yù)處理的保護作用可能與預(yù)處理使兒茶酚胺釋放減少而降低細(xì)胞內(nèi)鈣,從而抑制缺血引起的C

2、x43去磷酸化和細(xì)胞內(nèi)重新分布。另外,如前述,心肌缺血時由于交感神經(jīng)興奮、兒茶酚胺釋放,經(jīng)激動心肌beta-受體信號通路而導(dǎo)致鈣超載。采用激動該信號通路不同站點(如采用異丙腎上腺素激動beta-受體、采用Forskolin激動腺苷酸環(huán)化酶以及采用細(xì)胞外高鈣或鈣通道激動劑打開鈣通道)的方法都成功模擬了缺血預(yù)處理對心肌缺血的保護作用。由于針刺可以影響交感神經(jīng)的功能,因此針刺預(yù)處理就極有可能通過心肌beta-受體及其受體后的傳導(dǎo)通路,像缺血預(yù)

3、處理一樣,改善心肌細(xì)胞鈣超載、進(jìn)而改善鈣相關(guān)的Cx43的重塑過程,包括Cx43的數(shù)量、磷酸化的程度以及Cx43重新分布,最終降低因缺血再灌注導(dǎo)致的心律失常。
　　 本項研究采用結(jié)扎和再灌大鼠左冠狀動脈前降支的方法建立實驗性心肌局部缺血模型和離體心臟模擬全心缺血(低灌流)模型,首先確定電針預(yù)處理對缺血性心律失常的療效,并在此基礎(chǔ)上探討細(xì)胞內(nèi)鈣一縫隙連接因子Cx43在介導(dǎo)電針預(yù)治療改善缺血性心律失常中的作用,為針刺改善缺血性心律失常

4、提供分子水平的科學(xué)依據(jù)。此外,針刺預(yù)處理機制的闡明,也將有助于為采用針灸療法防治該病開辟一條新的途徑。
　　 實驗選用雄性成年大鼠Sprague-Dawley(SD)130只,體重215±35g,隨機分為正常對照組(NC組)、心肌缺血組(IR組)、電針預(yù)治療+心肌缺血組(EA組)、電針預(yù)治療+心肌缺血+Cx43拮抗劑18 beta-glycyrrhetinic acid(EAG)組以及電針預(yù)治療+心肌缺血+鈣通道激動劑Bay K

5、8644(EAB)組。EA組于每次麻醉后電針內(nèi)關(guān)30min(電針參數(shù):強度1-3mA,頻率2/15Hz變頻),連續(xù)三天；EAG組和EAB組分別于每次麻醉后先腹腔注射18 beta—glycyrrhetinic acid(160ug/kg)或Bay K8644(9.98ug/kg),30min后再電針內(nèi)關(guān)30min,連續(xù)三天。NC組、IR組僅于每次麻醉后捆綁30min,不做其他處理,連續(xù)三天。
　　 實驗包括三部分內(nèi)容:1電針預(yù)治

6、療對缺血性心律失常療效的確定；2探討心肌細(xì)胞內(nèi)鈣在電針預(yù)治療改善心肌缺血性心律失常中的作用；3探討縫隙連接因子Cx43重塑機制在電針預(yù)治療改善心肌缺血性心律失常中的作用。具體結(jié)果如下:
　　 1電針預(yù)治療對缺血性心律失常療效的確定
　　 采用Cuitis's Scoring System對各組的心律失常發(fā)生情況進(jìn)行評定。NC組心律失常評分為0分,表明NC組在再灌注10min內(nèi)沒有心律失常發(fā)生；IR組于再灌注10min內(nèi)出

7、現(xiàn)了不同的房性和室性的心律失常,其評分為3.75±0.25,明顯高于NC組(P<0.05)；經(jīng)電針治療后,EA組評分為0.75±0.25,與IR組比較,其心律失常發(fā)生率明顯下降(P<0.05)。
　　 2心肌細(xì)胞內(nèi)鈣在電針預(yù)治療改善心肌缺血性心律失常中的作用
　　 2.1電針預(yù)治療對模擬全心缺血大鼠單個心肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣水平的影響
　　 NC組單個心肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣離子濃度均值是73.67±1.08 nmol/L,而

8、IR組單個心肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣離子濃度均值為110.42±1.49 nmol/L,明顯高于NC組(P<0.01)；EA組單個心肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣離子濃度均值為85.42±1.56 nmol/L,與IR組比較,其鈣離子濃度顯著下降(P<0.01)；而當(dāng)每次電針預(yù)治療前給予Cx43拮抗劑-18beta-glycyrrhetinic acid或者鈣通道激動劑-Bay K8644時,EAG,EAB兩組單個心肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣離子濃度均值分別為110.42±

9、1.64 nmol/L,110.833±1.41 nmol/L,均明顯高于EA組(.P<0.01),說明Cx43拮抗劑和鈣通道激動劑均可以抑制電針預(yù)治療的保護作用。
　　 2.2電針預(yù)治療對模擬全心缺血大鼠單個心肌細(xì)胞靜息狀態(tài)下鈣振蕩的影響
　　 NC組單個心肌細(xì)胞發(fā)生鈣振蕩的次數(shù)為0次,表明NC組在靜息狀態(tài)下10min內(nèi)沒有鈣振蕩發(fā)生,而IR組于靜息狀態(tài)下10min內(nèi)出現(xiàn)了較為頻繁的鈣振蕩,其次數(shù)為43.83±2.68

10、次,明顯高于NC組(P<0.01)；經(jīng)電針預(yù)治療后,EA組靜息狀態(tài)下發(fā)生鈣振蕩的次數(shù)明顯下降,其次數(shù)為8.33±1.58次,明顯低于IR組(P<0.01)。而當(dāng)每次電針預(yù)治療前給予Cx43拮抗劑-18 beta-glycyrrhetinic acid或者鈣通道激動劑-Bay K8644時,EAG組和EAB組于靜息狀態(tài)下發(fā)生鈣振蕩的次數(shù)分別為:34±2.11次和48.75±3.34次,此二組發(fā)生鈣振蕩的次數(shù)均顯著高于EA組(P值均<0.0

11、1)。其結(jié)果表明Cx43拮抗劑和鈣通道激動劑均抑制了電針預(yù)治療的保護作用。
　　 2.3電針預(yù)治療對模擬全心缺血大鼠單個心肌細(xì)胞在電刺激下鈣振蕩的影響
　　 NC組單個心肌細(xì)胞在電刺激下10分鐘內(nèi)發(fā)生鈣振蕩的次數(shù)為0次,表明NC組單個心肌細(xì)胞可以在電場刺激下隨著電刺激的頻率有規(guī)律地收縮,沒有鈣振蕩的發(fā)生。而IR組單個心肌細(xì)胞在電場刺激下出現(xiàn)了較為頻繁的鈣振蕩,其次數(shù)為189.42±29.38次,明顯高于NC組(P<0.0

12、1)；經(jīng)電針預(yù)治療后,EA組單個心肌細(xì)胞在電場刺激下鈣振蕩的次數(shù)明顯下降,其次數(shù)為10.08±3.09次,明顯低于IR組(P<0.01)。與靜息狀態(tài)下類似,當(dāng)每次電針預(yù)治療前給予Cx43拮抗劑-18 beta-glycyrrhetinic acid或者鈣通道激動劑-Bay K8644時,EAG組和EAB組單個心肌細(xì)胞在電場刺激下亦出現(xiàn)了較為頻繁的鈣振蕩,其次數(shù)分別為:125.25±17.24次和289.83±25.98次,均明顯高于EA

13、組(P值均<0.01)。結(jié)果表明,18 beta-glycyrrhetinic acid和Bay K8644抑制了電針預(yù)治療的保護作用。
　　 3縫隙連接因子Cx43重塑機制在電針預(yù)治療改善心肌缺血性心律失常中的作用
　　 3.1電針預(yù)治療對模擬全心缺血大鼠心肌細(xì)胞膜Cx43蛋白總含量的影響
　　 以NC組大鼠心肌細(xì)胞膜上Cx43蛋白總含量作為100％,得到的各組心肌細(xì)胞膜上Cx43蛋白總含量的百分比分別為:IR

14、組82.25±0.02％,EA組83.99±0.02％,EAG組80.52±0.01％,EAB組86.14±0.01％,表明IR、EA、EAG和EAB各組與NC組比較Cx43蛋白總含量有所降低。而IR、EA、EAG和EAB各組大鼠心肌細(xì)胞膜上Cx43蛋白總含量無明顯變化(P值均>0.05),表明Cx43蛋白含量沒有參與介導(dǎo)針刺預(yù)治療抗缺血性心律失常的作用。以下需要進(jìn)一步分析Cx43磷酸化狀態(tài)在介導(dǎo)針刺預(yù)治療抗缺血性心律失常的作用。

15、>　　 3.2電針預(yù)治療對模擬全心缺血大鼠心肌細(xì)胞膜Cx43蛋白磷酸化狀態(tài)的影響
　　 以NC組為100％進(jìn)行比較,IR組非磷酸化的Cx43的含量的百分比為238±0.33％,明顯高于NC組(P<0.05)；其相應(yīng)的磷酸化的Cx43的含量的百分比為42.26±0.03％,明顯低于NC組(P<0.05),經(jīng)電針預(yù)治療后:EA組非磷酸化的Cx43的含量的百分比為108±0.06％,明顯低于IR組(P<0.05)；其相應(yīng)的磷酸化的C

16、x43的含量的百分比為89.21±0.25％,明顯高于IR組(P<0.05)。而EAG組和EAB組與IR組情況類似,兩組非磷酸化的Cx43的含量的百分比分別為:246±0.18％,253±0.16％,均明顯高于EA組(P值均<0.05),此二組相應(yīng)的磷酸化的Cx43的含量百分比分別為:39.26±0.01％和29.28±0.02％:均明顯低于EA組(P值均<0.05)。上述結(jié)果表明,電針預(yù)治療可以減低缺血引起的非磷酸化的Cx43的含量的