補(bǔ)腎壯骨中藥對(duì)頜骨牽張成骨影響的機(jī)制探討.pdf

1、目的：
　　 牽張成骨(distraction of osteogenesis,DO)作為活體骨組織工程的一種重要形式,為矯治各種先天及后天獲得性畸形或缺損提供了重要手段。作為內(nèi)源性組織工程技術(shù),該方法與傳統(tǒng)外科技術(shù)相比,具有諸多優(yōu)點(diǎn),如操作簡(jiǎn)單、術(shù)時(shí)短、創(chuàng)傷小、避免植骨及供區(qū)并發(fā)癥、軟組織可同期得到擴(kuò)張。但是,由于DO的療程相對(duì)較長(zhǎng),且有時(shí)會(huì)出現(xiàn)纖維性愈合、骨愈合不良、甚至骨不連等并發(fā)癥,這些問(wèn)題使得牽張成骨術(shù)的臨床應(yīng)用在一定

2、程度上受到了限制。目前,許多方法被嘗試用于促進(jìn)牽張骨痂形成,縮短DO固定期,這些方法包括應(yīng)用低頻超聲波、直流電或電磁場(chǎng)刺激、高壓氧治療、系統(tǒng)應(yīng)用生長(zhǎng)激素、以及局部應(yīng)用生長(zhǎng)因子、骨形成蛋白等。部分方法獲得了一定的效果,然而所有上述手段均未獲得廣泛的臨床應(yīng)用。
　　 中醫(yī)中藥在醫(yī)學(xué)的某些領(lǐng)域已顯示出其獨(dú)特、不可替代的作用和地位。中醫(yī)中藥能加速骨折的愈合,早已被臨床證實(shí)。祖國(guó)醫(yī)學(xué)在促進(jìn)新骨形成、骨折愈合方面積累了大量經(jīng)驗(yàn)。隨著各種研究

3、方法的介入,其治療骨折的部分機(jī)制,目前已經(jīng)闡明。在促進(jìn)牽張成骨方面,在我們以往的研究中,已觀察到補(bǔ)腎壯骨中藥可以促進(jìn)下頜骨牽張成骨的作用,補(bǔ)腎壯骨中藥如何促進(jìn)成骨,通過(guò)什么途徑促進(jìn)牽張成骨,目前還是未知。一些研究表明,傳統(tǒng)中藥可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和增殖,可通過(guò)調(diào)節(jié)成骨基因、細(xì)胞因子促進(jìn)骨折的愈合。因此,借鑒在治療骨折等方面的成功經(jīng)驗(yàn),中醫(yī)中藥在縮短牽張成骨療程方面必能發(fā)揮巨大作用,使得牽張成骨更加完善,手術(shù)并發(fā)癥更少,患者更容易接受,因此

4、有著廣闊的應(yīng)用前景。
　　 本研究首先應(yīng)用補(bǔ)腎壯骨中藥含藥血清作用于體外培養(yǎng)的犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow stem cells,MSCs),觀察中藥對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化增殖的影響,同時(shí)也檢測(cè)中藥對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、骨保護(hù)素(osteocalcin,OPG)和細(xì)胞核因子κΒ受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor

5、κΒ ligand,RANKL)等成骨的作用,探討補(bǔ)腎壯骨中藥對(duì)牽張成骨骨改建的作用機(jī)理;本研究將補(bǔ)腎壯骨中藥應(yīng)用于犬下頜骨牽張成骨,采用組織形態(tài)學(xué)、骨組織計(jì)量學(xué)及骨鈣素(osteocalcin,OCN)mRNA的表達(dá),觀察下頜骨牽張成骨過(guò)程中補(bǔ)腎壯骨中藥對(duì)成骨質(zhì)量和骨鈣素的影響。本研究擬從細(xì)胞水平和分子水平初步探討補(bǔ)腎壯骨中藥促進(jìn)骨再生和加速骨愈合的機(jī)制,為補(bǔ)腎壯骨中藥在DO中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法
　　

6、 1補(bǔ)腎壯骨中藥對(duì)犬骨髓干細(xì)胞成骨分化增殖的影響
　　 (1)MSCs原代培養(yǎng)、誘導(dǎo)培養(yǎng)及成骨活性的鑒定
　　 2只Beagle犬由脛骨獲取骨髓,經(jīng)Ficoll分離液進(jìn)行梯度離心,MSCs經(jīng)含胎牛血清的DMEM培養(yǎng),傳代后在培養(yǎng)液加入礦化誘導(dǎo)液(β-甘油磷酸鈉,維生素C和地塞米松)促使其向成骨細(xì)胞分化,I型膠原蛋白免疫組化鑒定成骨細(xì)胞,銀染色和茜素紅染色鑒定鈣結(jié)節(jié)。
　　 (2)實(shí)驗(yàn)分組及含藥血清的制備
　

7、　 實(shí)驗(yàn)分為含藥血清組(A組)、無(wú)藥血清組(B組)和胎牛血清組(C組)。含藥血清組的血清來(lái)自補(bǔ)腎壯骨中藥經(jīng)煎制后,按體表面積折算等效劑量,2只Beagle犬連續(xù)喂服7天后經(jīng)股動(dòng)脈采血制備而成。無(wú)藥血清組的血清來(lái)自等劑量生理鹽水2只Beagle犬喂服7天后經(jīng)股動(dòng)脈采血制備而成。胎牛血清組的血清直接購(gòu)買。
　　 (3)含藥血清對(duì)MSCs分化生長(zhǎng)的影響
　　 分別將第3代MSCs在含藥血清(A組)、無(wú)藥血清(B組)和胎牛血清

8、(C組)的誘導(dǎo)礦化液+DMEM中培養(yǎng)。通過(guò)四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法觀察MSCs分化生長(zhǎng)的情況。
　　 (4)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性的檢測(cè)
　　 分別將第3代MSCs在含有含藥血清(A組)、無(wú)藥血清(B組)和胎牛血清(C組)的誘導(dǎo)礦化液+DMEM中培養(yǎng)。檢測(cè)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性。
　　 2補(bǔ)腎壯骨中藥血清對(duì)成骨細(xì)胞OPG、RANKL mRNA表達(dá)的影響
　　 將第3代MSCs在含

9、有含藥血清(A組)、無(wú)藥血清(B組)和胎牛血清(C組)的誘導(dǎo)礦化DMEM中培養(yǎng)。采用原位雜交的方法檢測(cè)成骨細(xì)胞OPG和RANKL rnRNA的表達(dá)情況。
　　 3頜骨牽張成骨過(guò)程中補(bǔ)腎壯骨中藥對(duì)成骨質(zhì)量和骨鈣素的影響
　　 選用16只Beagle犬隨機(jī)分為中藥組和對(duì)照組,所有動(dòng)物行右側(cè)下頜骨劈開(kāi)后植入常規(guī)組合式骨牽張器,經(jīng)7天延遲后,以0.5mm/12h的牽張速度,連續(xù)10天。中藥組動(dòng)物自牽張器植入術(shù)后第一天口服補(bǔ)腎壯骨

10、中藥至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。分別于固定1周、2周、3周、4周后每組處死2只Beagle犬,留取標(biāo)本后進(jìn)行組織學(xué)觀察、骨組織計(jì)量學(xué)分析及骨鈣素的檢測(cè)。
　　 結(jié)論
　　 1補(bǔ)腎壯骨中藥能明顯促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化增殖,提高成骨細(xì)胞的活性。
　　 2補(bǔ)腎壯骨中藥可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分泌OPG、RANKL的功能,從而降低破骨細(xì)胞的活力,促進(jìn)成骨過(guò)程,提高骨密度。
　　 3補(bǔ)腎壯骨中藥在體內(nèi)能有效地加速下頜骨牽張過(guò)程