補腎壯骨中藥對模擬微重力成骨細胞的影響.pdf

1、失重即微重力，是物體只表現為質量而不表現為重量的特殊力學環(huán)境（10-6～10-9g）。在失重飛行引起的一系列人體生理系統(tǒng)變化中，其他生理系統(tǒng)的變化在航天飛行中會達到一種新的平衡狀態(tài)，返回地面后，經過一段時間可以很快恢復。但骨鈣的丟失卻持續(xù)發(fā)展，引起失重性骨質疏松。骨代謝的調節(jié)失衡是影響宇航員健康的主要問題。已證實失重性骨質疏松的骨丟失主要是由于骨形成的減少而不是骨吸收的增加。目前航天中采用的各種對抗措施均未能起到理想的效果，因此預防失重

2、性骨丟失的研究已成為國內外航天醫(yī)學領域的重點和熱點課題。 我國傳統(tǒng)醫(yī)學，博大精深，已證實對原發(fā)骨質疏松癥有較好的療效及較強的優(yōu)勢。補腎療法是中醫(yī)治療骨質疏松癥的重要方法，其理論基礎源于中醫(yī)“腎主骨生髓”學說。《醫(yī)經精義》日：“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所以合也，髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內，髓足則骨強?！毖a腎壯骨中藥主要由淫羊藿、生地黃、補骨脂、川續(xù)斷等組成。我們將中醫(yī)藥理論運用于航天醫(yī)學研究，在前期的整體實驗中

3、我們已經從骨密度、骨生物力學、骨組織形態(tài)學、骨生化學各角度對補腎壯骨中藥進行了深入研究，證明其對尾吊模擬失重大鼠骨丟失有明顯的改善作用。但其在細胞學上改變尚不明確，故本實驗選擇中藥復方仙靈骨葆膠囊制備含藥血清。復方仙靈骨葆膠囊是富含植物雌激素的草藥制劑，分別含有金雀異黃酮510μg/g、大豆黃素2500μg/g、淫羊藿9200μg/g、補骨脂素930μg/g和異補骨脂素950μg/g，是具有代表性的方劑之一。本實驗在研究補腎壯骨中藥對失

4、重骨代謝影響整體實驗的基礎上，觀察了該方對體外模擬失重培養(yǎng)的成骨細胞的影響，擬揭示該方對抗骨丟失的細胞學改變。 目的: 本研究主要從細胞學層面上探討補腎壯骨中藥對模擬失重條件下體外培養(yǎng)成骨細胞的影響，擬在細胞水平上揭示該方對抗骨丟失的機制，以期為失重性骨質疏松的臨床治療研究提供新的線索。 對象和方法: 1.成骨細胞的分離、培養(yǎng)、擴增：取新生1d SD大鼠乳鼠，無菌條件下取顱頂骨，去除周圍組織；DMEM培養(yǎng)

5、基漂洗后將其剪碎成小于0.5mm3的碎片，經0.25%胰蛋白酶預消化15～20min，間斷振蕩，棄上清；加入0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型膠原酶混合液，37℃5%CO2恒溫孵育箱內消化30min，間斷振蕩，取上清液1，000rpm離心5min，收集細胞接種于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，第3d首次換液，第6d首次傳代。以后每3d換液一次，5d傳代一次。臺盼藍染色記數檢測原代細胞懸液活細胞率。依據貼

6、壁培養(yǎng)法分離和擴增成骨細胞，繪制細胞生長曲線，取前6代細胞作為試驗對象。 2.成骨細胞功能鑒定：采用改良Gomori鈣鈷法堿性磷酸酶（ALP）染色觀察，Von Kossa's礦化結節(jié)染色法檢測體外礦化能力。 3.復方中藥含藥血清制備：取健康雄性SD大鼠共28只，隨機分為2組。用藥組18只，均灌胃給藥（復方仙靈骨葆膠囊）一日2次連續(xù)5次，于末次給藥后1～2小時，乙醚麻醉無菌條件下經腹主動脈采血，冷置1h后離心分離血清，經5

7、6℃30min滅活，0.22μm濾膜抽濾除菌，是為含藥血清，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。正常對照組和模擬失重組，各5只，按相同程序灌等體積水，所取血清是為正常血清，作為對照用。大鼠灌胃給藥劑量均按人日用臨床劑量，經人一大鼠體表面積比值折算成相當于臨床劑量，以4倍量給藥。 4.建立模擬微重力成骨細胞模型、分組干預：實驗分為正常對照組，失重模型組和含藥血清不同濃度組，將微載體0.5g和1×107個成骨細胞加入旋轉式生物反應器中，添加含10

8、%FBS和5%對照血清（或含藥血清，終濃度分別為5%、10%、20%）的DMEM培養(yǎng)基至50ml，排空氣泡。調整轉速使細胞與微載體的黏附物能隨反應器內外筒一起以較為理想的運行軌跡與轉筒一起運動后，逐漸加大轉速直至30rpm（相當于10-3G的微重力狀態(tài)）。置于37℃5%CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)72h。 5.ALP、BGP活性測定：對硝基苯酚法測定含藥血清作用72h后培養(yǎng)液中ALP活性，放射免疫測定法測定BGP活性。 6.成

9、骨細胞凋亡檢測：細胞干預培養(yǎng)72h后，胰蛋白酶常規(guī)消化，制成細胞懸液，PBS洗滌幾次，將細胞重懸于200μL的Binding Buffer，加入10μLannexin V-FITC和5μL PI，混勻，避光室溫反應15min，加入300μL BindingBuffer，用流式細胞儀檢測Annexin-V陽性細胞。 結果: 1.成骨細胞生長情況：經“兩步消化-組織塊培養(yǎng)法”提取的成骨細胞，在相差顯微鏡下呈三角形、菱形、多邊

10、形等不規(guī)則形狀，透明度好。細胞有觸突，胞漿豐富并向外伸展，伸出幾個突起與臨近細胞伸出的突起相連，有聚集成團（集落）的現象。胞核大而清楚，呈圓形或卵圓形，含1～2個核仁。組織塊培養(yǎng)法第3天，倒置顯微鏡下可見大量成骨細胞從組織塊周邊爬出，培養(yǎng)第5天，移出的細胞明顯增加，以骨塊為中心，向周圍呈放射生長，間雜成纖維細胞后期用差異貼壁法分離純化。7天后細胞基本鋪滿單層；組織塊培養(yǎng)法需10天細胞鋪滿單層。長滿瓶底時，細胞為梭形及立方塊狀，排列緊密，

11、可見圓形或鱗片形細胞。隨著培養(yǎng)時間的延長，成骨細胞可呈多層生長。 2.細胞活力測定：臺盼藍染色后，藍染細胞為死亡細胞。按未被藍染細胞所占細胞總數的百分比即為初步得到細胞活力的數據，本實驗活細胞率95%～99%。 3.成骨細胞的鑒定 （1）ALP活性染色：細胞鈣鈷法染色顯示呈強陽性，細胞胞漿內可見灰、黑顆粒定位于酶活性之處，證明細胞內有活性ALP的表達。 （2）體外礦化能力檢測：末次傳代的細胞生長至3、4周

12、后細胞呈復層狀生長，中心部細胞密集可發(fā)生鈣化，形成肉眼可見的散在白色點狀物。Von Kossa's法礦化結節(jié)染色后，鈣鹽沉積區(qū)域呈黑色，背景紅色。 4.在體外模擬失重條件下，失重模型組與對照組相比，成骨細胞培養(yǎng)液中ALP、BGP活性均有顯著降低（t=17.033，P=0.000；t=7.886，P=0.001），表明已建立了模擬失重成骨細胞模型。與對照組相比，失重模型組成骨細胞凋亡率顯著升高（t=11.214，P=0.000），

13、說明失重可引起成骨細胞凋亡增加。 5.中藥復方對體外模擬失重條件下成骨細胞培養(yǎng)液中ALP活性的影響：模擬失重條件下，各培養(yǎng)組間ALP活性有顯著性差異（F=82.053，P=0.000）。較之失重模型組，含藥血清不同濃度組細胞培養(yǎng)液中的ALP活性均有不同程度升高，其中該方含藥血清10%和20%濃度組ALP活性升高顯著（P=0.000，P=0.000）。含藥血清5%，10%和20%濃度組間兩兩比較均有顯著性差異（P=0.000，P=

14、0.000，P=0.020）0。 6.中藥復方對體外模擬失重條件下成骨細胞培養(yǎng)液中BGP的影響：模擬失重條件下，各培養(yǎng)組間BGP活性有顯著性差異（F=18.907，P=0.001）。與失重模型組比較，含藥血清不同濃度組細胞培養(yǎng)液中的BGP活性均有不同程度升高，其中該方含藥血清20%濃度組BGP活性顯著升高（P=0.001）。含藥血清10%和20%濃度組間比較有顯著性差異（P=0.015），兩者與5%濃度組比較BGP活性均無明顯變

15、化（P=1.000，P=1.003）。 7.中藥復方對體外模擬失重條件下成骨細胞凋亡的抑制作用：模擬失重條件下，各培養(yǎng)組間成骨細胞細胞凋亡率有顯著性差異（F=23.971，P=0.000）。與失重模型組比較，含藥血清不同濃度組成骨細胞凋亡率均有不同程度降低，其中該方含藥血清10%和20%濃度組成骨細胞凋亡率顯著降低（P=0.002，P=0.000）。含藥血清5%和20%濃度組間比較有顯著性差異（P=0.007），兩者與10%濃度