“補(bǔ)腎壯骨合劑”在同種異體骨修復(fù)骨缺損中的作用及其機(jī)制探討.pdf

1、目的：探討兼活血化瘀的“補(bǔ)腎壯骨合劑”（骨碎補(bǔ)250克、續(xù)斷250克、自然銅400克，土鱉蟲100克加99公斤普通飼料配制100公斤飼料）在同種異體骨修復(fù)骨缺損過程中的作用，并通過觀察修復(fù)區(qū)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）探討其可能的機(jī)制。
　　方法：普通家兔70只、體重為2.0-2.5kg、雌雄不限、分籠喂養(yǎng)。其中60只隨機(jī)分成1周組、2周組、4周組、6周組、8周組，共5組；每組12只又分為實(shí)驗(yàn)組和對照組；實(shí)驗(yàn)組和對照組各為6只；每

2、只家兔均取雙側(cè)橈骨。另10只普通家兔為異體骨提供組，均取雙側(cè)髂骨。從耳緣靜脈注入10ml空氣造成空氣栓塞致死后，取髂骨制成1X1X2mm的顆粒狀骨。實(shí)驗(yàn)組和對照組普通家兔均用巴比妥鈉20mg/kg靜脈麻醉后，在無菌條件下暴露橈骨中下1/3段，用骨磨鉆制成20mm的骨缺損模型（完全切除骨膜）。用顆粒狀異體骨修復(fù)骨缺損。實(shí)驗(yàn)組用“補(bǔ)腎壯骨合劑”配制飼料飼養(yǎng)，對照組用普通飼料飼養(yǎng)。術(shù)后肌肉注射頭孢唑林鈉連續(xù)4天，預(yù)防切口感染。分別在術(shù)后1、2

3、、4、6、8周處死，拍橈骨的X線后取材。實(shí)驗(yàn)組和對照組中，每組隨機(jī)各取2只普通家兔作為實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）的標(biāo)本；再隨機(jī)取2只普通家兔作為電鏡的標(biāo)本；取剩余的2只普通家兔標(biāo)本作為HE和原位雜交。
　　結(jié)果： X線拍片觀察：實(shí)驗(yàn)組，1周無明顯變化；2周有少量骨痂形成；4周骨痂明顯增多；6周骨缺損處模糊；8周骨缺損處大量骨痂形成，骨缺損消失，骨髓腔形成；對照組比實(shí)驗(yàn)組在同時(shí)期的骨痂量相對較少。x線片吸光度比值，不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)

4、驗(yàn)組均高于對照組，P<0.05。HE組織學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)組1周，移植骨內(nèi)有部分骨細(xì)胞壞死、部分細(xì)胞核濃縮、甚者消失，血腫內(nèi)有成纖維細(xì)胞增生并伴有炎性細(xì)胞；2-4周時(shí)新生骨長入移植骨內(nèi)有少量軟骨細(xì)胞形成，同時(shí)伴有大量血管生長，移植骨內(nèi)細(xì)胞明顯吸收并有核濃縮碎裂現(xiàn)象；4-8周時(shí)植骨區(qū)的血管數(shù)量增多，有明顯網(wǎng)狀新生骨生成，有板層骨、骨髓腔的形成。對照組1周時(shí)與實(shí)驗(yàn)組無明顯變化；2-4周有少量軟骨細(xì)胞和血管形成；6-8周骨痂量增多并伴有血管的增多，

5、但板層骨、骨髓腔尚未形成。血管橫截面積百分比，不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組均高于對照組，P<0.05。電鏡觀察：1周時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對照組均有部分骨小梁破壞和部分壞死組織，并有炎性細(xì)胞產(chǎn)生；2周實(shí)驗(yàn)組間充質(zhì)細(xì)胞呈梭形改變，周圍有少量纖維成分，骨細(xì)胞核濃縮，染色質(zhì)凝聚靠邊，而對照組無明顯間充質(zhì)細(xì)胞生成，少量的纖維滲出，核基質(zhì)致密靠邊；4周實(shí)驗(yàn)組毛細(xì)血管數(shù)量增多，骨細(xì)胞骨陷窩及骨小梁形成，而對照組毛細(xì)血管數(shù)量相對較少，周圍有骨基質(zhì)形成；6周實(shí)驗(yàn)組骨基質(zhì)和骨細(xì)

6、胞核仁比較明顯，胞質(zhì)內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量增多，編織骨明顯，而對照組骨基質(zhì)表面形成部分骨細(xì)胞、骨小梁及骨小管；8周實(shí)驗(yàn)組板層骨形成。而對照組成骨細(xì)胞數(shù)量少及周圍骨質(zhì)增多，編織骨明顯，無明顯的板層骨。原位雜交：實(shí)驗(yàn)組BMP-2的表達(dá)，1周呈陰性；2周呈弱陽性；4周呈強(qiáng)陽性；6-8周后均呈陽性。對照組BMP-2的表達(dá)，1周呈陰性；除4周時(shí)呈陽性之外，2、6、8周均呈弱陽性。RT-PCR結(jié)果：BMP-2目的基因在94℃30 sec55～65℃30 se

7、c30 Cycles72℃1 min/kbp的條件下，對照組：1周，2547±2拷貝；2周，4972±1拷貝；4周，1230±3拷貝；6周，411±2拷貝；8周856±4拷貝。實(shí)驗(yàn)組：1周，5397±3拷貝；2周3171±2拷貝，4周1981±2拷貝，6周1978±4拷貝，8周501±2拷貝。以一周拷貝為基礎(chǔ)經(jīng)校正后為1，其他各周與其比較，對照組：1周，1.00±0.00；2周，2.19±0.01；4周，3.2±0.03；6周，2.29