犬下頜骨牽張成骨與胚胎成骨RNA表達(dá)譜關(guān)聯(lián)性分析.pdf

1、研究背景：
　　牽張成骨(Distraction osteogenesis，DO)是指在低能量創(chuàng)傷致使的人為骨折情況下，對(duì)骨折端之間通過(guò)特制的鈦金屬牽張器來(lái)施加一個(gè)緩慢的牽引力，使逐漸牽張開(kāi)的間隙中產(chǎn)生新骨的過(guò)程，通常被用來(lái)為骨發(fā)育不全、骨缺損制造新骨修復(fù)，在臨床上已經(jīng)被證明是極其有效的治療手段。牽張成骨的成骨效率高、效果較穩(wěn)定，每日可在牽張間隙成骨達(dá)到1mm，速率達(dá)到嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育速度4-6倍，并且暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)有成骨量的限制。牽張

2、成骨的機(jī)制非常復(fù)雜，其成骨的高效率，超越了過(guò)去人們所有對(duì)骨質(zhì)生成的認(rèn)識(shí)。牽張成骨的分子學(xué)機(jī)制，是否和骨折愈合(healing)相似，還是另一種形式的骨再生(regeneration)，亦或是兩者共存的發(fā)展形式，至今仍然未完全清楚。
　　研究目的：
　　牽張成骨的效率極高，達(dá)到嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育速度的4至6倍，因此我們提出假想，牽張成骨中牽引機(jī)械力或者微創(chuàng)傷等因素，可能激活了機(jī)體僅在胚胎發(fā)育期或新生發(fā)育期才活躍的某種因子或信號(hào)通路

3、，從而主導(dǎo)了一種與骨修復(fù)甚至骨再生不同的骨生成過(guò)程，這可能是一種近似于返祖的生物學(xué)過(guò)程。為探明其中的機(jī)制，本研究構(gòu)建了犬下頜骨牽張成骨模型及妊娠犬孕胚胎犬模型，利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)牽張后即刻取材和固定2周取材的下頜骨牽張區(qū)骨組織、胚胎犬下頜骨組織、骨折犬骨折區(qū)組織、新生犬、2周/4周幼犬和正常成年犬的下頜骨骨組織進(jìn)行mRNA及miRNA的全基因組表達(dá)譜測(cè)序。通過(guò)對(duì)牽張組和其他組下頜骨骨組織的mRNA和miRNA進(jìn)行全基因組表達(dá)差異

4、與關(guān)聯(lián)性分析，更全面地了解牽張成骨與胚胎發(fā)育、骨折愈合成血管成骨的異同點(diǎn)，并探索牽張成骨可能的啟動(dòng)因素、新骨形成的獨(dú)特性、血管發(fā)生等相關(guān)聯(lián)的mRNA和miRNA表達(dá)情況及其參與信號(hào)通路的情況，篩選出具有關(guān)鍵作用的基因，為后續(xù)的驗(yàn)證研究提供關(guān)鍵基因表達(dá)譜。
　　研究方法：
　　1、廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供實(shí)驗(yàn)中華田園犬共33只。分成11組:(1)牽張后即刻取材組(DO-1)，3只;(2)牽張后固定2周組（DO-2），3只;

5、(3)新生犬組(P-0)，3只;(4)2周幼犬組（P-2），3只;(5)4周幼犬組(P-4)，3只;(6)孕期30天胚胎組(E-1)，3只;(7)孕期35天胚胎組（E-2），3只;(8)孕期50天胚胎組(E-2)，3只;(9)正常對(duì)照組(AC)，3只;(10)骨折1組(BF-1)，3只;(11)骨折2組(BF-2)，3只。牽張各組處置:牽張即刻取材組和牽張固定2周組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均接受單側(cè)下頜骨單線牽張成骨術(shù)，并于牽張結(jié)束即刻和牽張結(jié)束固定

6、2周后處死，取材牽張區(qū)骨組織，通過(guò)標(biāo)本大體觀察、處死前CBCT影像學(xué)觀察和HE染色組織學(xué)觀察以確定牽張效果。胚胎組處置:經(jīng)過(guò)術(shù)前B超確認(rèn)孕期，對(duì)孕期30天、35天、50天的妊娠犬執(zhí)行剖腹引產(chǎn)手術(shù)，取材各組活體胚胎，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行大體觀察和HE染色，剖腹后妊娠犬回籠飼養(yǎng)。骨折組處置:對(duì)實(shí)驗(yàn)犬執(zhí)行骨折手術(shù)，通過(guò)鈦板保持骨折間隙，骨折兩組對(duì)應(yīng)牽張組以作對(duì)照，骨折1組指骨折固定14天后取材（對(duì)應(yīng)DO-1組5天的間隙期、7天的牽張期）、骨折2組指骨折

7、固定28天后取材（對(duì)應(yīng)DO-2組5天的間隙期、7天的牽張期以及2周的固定期）。另取新生半小時(shí)內(nèi)幼犬3只，出生2周、4周幼犬各3只，以及非手術(shù)健康成年犬3只，分別納入新生犬組(P-0)、2周幼犬組(P-2)、4周幼犬組（P-4）和正常對(duì)照組(AC)，予以處死取單側(cè)下頜骨骨組織為標(biāo)本。以上動(dòng)物除妊娠犬外均雌雄不限，成年犬年齡1.5-2.0歲，體重12.5kg±2.5kg(平均13.5kg)。
　　2、提取各組骨組織標(biāo)本的總RNA，經(jīng)質(zhì)

8、檢明確其濃度及純度合格后，同時(shí)建立mRNA及miRNA測(cè)序cDNA文庫(kù)，文庫(kù)回收純化后，由Illumina公司Hiseq4000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。
　　3、通過(guò)高通量測(cè)序獲得mRNA、miRNA表達(dá)譜，將原始數(shù)據(jù)行mRNA、miRNA基因表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化統(tǒng)計(jì)后，將11組樣本分成55個(gè)兩兩對(duì)比組(1-vs-1)及36組的三實(shí)驗(yàn)組間比對(duì)(1-vs-1&1)，對(duì)各對(duì)比組行mRNA、miRNA差異基因篩選，以及差異mRNA的GO富集分析和KE

9、GG富集分析，并在此差異基因庫(kù)里二次篩選能夠提示牽張組、胚胎組、骨折組、正常對(duì)照組之間生物學(xué)層面異同點(diǎn)的興趣基因，并作差異性與關(guān)聯(lián)性分析。
　　研究結(jié)果：
　　1、牽張即刻組和牽張固定2周組實(shí)驗(yàn)犬均手術(shù)過(guò)程順利，術(shù)后無(wú)不良反應(yīng)。牽張器固定牢靠，無(wú)松脫、斷裂及變形。觀察所有實(shí)驗(yàn)犬尖牙咬合關(guān)系較牽張前呈下頜左偏突頜改變，下頜骨牽張間隙有類骨樣新生物質(zhì)，說(shuō)明右側(cè)頜骨成功通過(guò)牽張延長(zhǎng)。胚胎各組通過(guò)剖腹引產(chǎn)術(shù)取得活體犬胚胎，手術(shù)過(guò)程順

10、利，取得胎體完整，形態(tài)符合各孕期應(yīng)有的發(fā)育形態(tài)，妊娠犬經(jīng)引產(chǎn)后無(wú)不良反應(yīng)，持續(xù)生存。骨折各組手術(shù)過(guò)程順利，術(shù)后尖牙咬合關(guān)系能顯示下頜左偏突頜改變，術(shù)區(qū)未出現(xiàn)嚴(yán)重感染，鈦板及鈦釘無(wú)松脫、斷裂及變形，骨折兩端見(jiàn)纖維樣組織增生，無(wú)類骨樣物質(zhì)可被辨識(shí)。新生犬幼犬組和正常對(duì)照犬組取材過(guò)程順利，無(wú)特殊。
　　2、從11組樣本中均提取出足量的總RNA，并分別成功構(gòu)建了用于mRNA及miRNA測(cè)序所需的cDNA文庫(kù)。成功完成了犬下頜骨牽張區(qū)及正常

11、下頜骨骨組織的高通量測(cè)序。
　　3、本次測(cè)序共獲得22523個(gè)表達(dá)mRNA基因，綜合55個(gè)兩兩對(duì)比組和36組三組間比較（1-vs-1&1），通過(guò)對(duì)差異表達(dá)mRNA進(jìn)行分析后，我們發(fā)現(xiàn)了在牽張即刻組和胚胎犬組都共同表達(dá)上調(diào)、而正常組相對(duì)下調(diào)的mRNA共50個(gè)，以CXCL12、MINOS1、OGN、POSTN、PTN、SFRP2、MFAP5、IGFBP5、HSPB6等最具特征性，其中基因MINOS1、MFAP5、HSPB6均在正常成年

12、犬中幾乎無(wú)表達(dá)。以上基因功能囊括EMT調(diào)控、血管發(fā)生調(diào)控、間充質(zhì)干細(xì)胞及成骨細(xì)胞動(dòng)員等。牽張組與骨折組之間具有聯(lián)系的基因有1921個(gè)，以ATF4、CD99L2、IGFBP5、RPL15等特征性最強(qiáng)，這些基因在牽張組和骨折組中具有不同的特征性表達(dá)趨勢(shì)，主要為EMT調(diào)控，且相對(duì)于正常組中均顯著表達(dá)（上調(diào)或下調(diào)），代表了牽張成骨與骨折愈合的不同特點(diǎn)。
　　4、本次測(cè)序還獲得354個(gè)表達(dá)miRNA，根據(jù)以上對(duì)比組，牽張各組與胚胎各組共同高

13、表達(dá)、并在正常組相對(duì)下調(diào)表達(dá)的基因共46個(gè)，尤以miR-136、miR-299、miR-369、miR-376a、miR-380、miR-382、miR-410、miR-432、miR-503、miR-20a、miR-23a、miR-126、miR-370、miR-433最具特征性，其中基因cfa-miR-370、cfa-miR-433均在正常成年犬中無(wú)表達(dá)。以上基因功能表達(dá)囊括血管發(fā)生與血管生成調(diào)控;胚胎干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)

14、胞動(dòng)員;血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移;成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞分化調(diào)控;成肌調(diào)控等。此外，我們篩選出牽張組與骨折組之間具有聯(lián)系的基因，并對(duì)AC組亦同等量級(jí)表達(dá)的基因進(jìn)行排除。獲得了候選基因miR-203、miR-204、miR-205、miR-338、miR-9和miR-34a，這些基因在牽張組和骨折組中具有特征性的表達(dá)趨勢(shì)，并相對(duì)于AC組有顯著表達(dá)（上調(diào)或下調(diào)），主要為EMT調(diào)控，提示了牽張成骨與骨折愈合之間基因異同性表達(dá)的時(shí)空特點(diǎn)，揭示牽張成骨與骨折

15、愈合各自的成血管化及成骨化特點(diǎn)。
　　結(jié)論：
　　牽張成骨中，受初期微創(chuàng)傷造成的缺血性環(huán)境影響、炎癥反應(yīng)刺激、機(jī)械牽張力刺激或固定期靜態(tài)牽張力刺激所啟動(dòng)，出現(xiàn)以下生物學(xué)過(guò)程:大量基因自胚胎發(fā)育期后二次顯著表達(dá)并調(diào)控以血管發(fā)生(vasculogenesis)為主的成血管化，同時(shí)牽張成骨的早期機(jī)體的血管生成(Angiogenesis)機(jī)制受抑制，固定期后期有多個(gè)基因參與了對(duì)過(guò)載發(fā)育的血管網(wǎng)的限控;免疫性單核細(xì)胞受誘導(dǎo)向血管內(nèi)皮細(xì)

16、胞分化;上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)被顯著抑制，大量的間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為上皮及內(nèi)皮細(xì)胞以形成新的血管網(wǎng);熱休克蛋白受啟動(dòng)，維持細(xì)胞骨架穩(wěn)定來(lái)強(qiáng)化成血管化及成骨化過(guò)程;多個(gè)基因調(diào)控的大量骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞快速增殖向成骨細(xì)胞分化、既有的成骨細(xì)胞募集、牽張區(qū)肌肉組織分泌特異蛋白促進(jìn)骨代謝，維持著新骨快速生成。相較之下，骨折愈合過(guò)程中表達(dá)基因與牽張成骨差異較明顯，部分基因啟動(dòng)較牽張成骨緩慢，EMT進(jìn)程相較于牽張成骨顯著活躍，愈合過(guò)程缺乏快速成血管