B(a)P代謝產(chǎn)物BPDE的檢測(cè)技術(shù)及其對(duì)DNA損傷的研究.pdf

1、苯并(a)芘[benzo(a)pyrene，B(a)P]，又名3，4-苯并芘，由一個(gè)苯環(huán)和一個(gè)芘分子結(jié)合而成,是一種廣泛存在于人們生產(chǎn)、生活環(huán)境中的污染物。1933年，英國(guó)學(xué)者從煤焦油中分離出苯并芘（B(a)P），并成功誘發(fā)出小鼠皮膚癌，使B(a)P成為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的環(huán)境化學(xué)致癌物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，B(a)P對(duì)局部或全身都有致癌作用；流行病學(xué)研究表明，B(a)P可以通過(guò)皮膚、呼吸道、消化道等多種途徑被人體吸收，能夠誘發(fā)皮膚癌，肺癌，直腸癌

2、，胃癌，膀胱癌等。除致癌外，B(a)P還具有致畸，致突變作用，對(duì)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)也有一定的干擾作用。1983年國(guó)際癌癥機(jī)構(gòu)將其確認(rèn)為環(huán)境致癌物。 B(a)P雖然被認(rèn)為是高活性致癌劑，但并非直接致癌物，必須經(jīng)細(xì)胞微粒體中的混合功能氧化酶激活才具有致癌性。B(a)P在體內(nèi)首先經(jīng)混合功能氧化酶細(xì)胞色素P450酶(CYP1A1)催化在結(jié)構(gòu)彎區(qū)形成7,8環(huán)氧苯并芘,然后在環(huán)氧化物酶和CYP1B1作用下形成7,8二氫二醇苯并芘,該物質(zhì)經(jīng)混合功

3、能氧化酶催化,形成二氫二醇環(huán)氧苯并(a)芘(BPDE)。BPDE能夠與與體內(nèi)生物大分子如DNA，蛋白質(zhì)等結(jié)合生成共價(jià)化合物，被認(rèn)為是B(a)P在體內(nèi)的終致癌物。因此隨著B(niǎo)(a)P越來(lái)越深入的研究，BPDE的致癌性也受到廣泛關(guān)注，但是具體作用機(jī)制尚不明確。 BPDE主要與DNA的小溝上的親核位點(diǎn)鳥(niǎo)嘌呤的環(huán)外胺基端共價(jià)結(jié)合,產(chǎn)生特異突變,形成BPDE-N2-dG。BPDE加合物能夠阻止DNA復(fù)制，造成復(fù)制阻斷，復(fù)制準(zhǔn)確性降低，誘發(fā)加

4、合物對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上的堿基誤滲，最終出現(xiàn)G-T的轉(zhuǎn)變及部分G-A的錯(cuò)誤突變，這既是癌變的啟動(dòng)因子，又在癌變發(fā)展過(guò)程起著關(guān)鍵的作用。 B(a)P主要存在于煤焦油、各類(lèi)碳，石油等燃燒時(shí)產(chǎn)生的煙氣、汽車(chē)尾氣中，還有工業(yè)廢水中及吸煙時(shí)香煙產(chǎn)生的煙霧中。另外燒烤和熏制食品也含有大量的B(a)P。因此除了職業(yè)暴露外，在生活中也會(huì)經(jīng)常接觸到B(a)P。鑒于B(a)P對(duì)人類(lèi)的危害性，這幾十年來(lái)已經(jīng)有大量的研究報(bào)道了B(a)P的終致癌物質(zhì)BPDE的檢測(cè)

5、方法，但其絕大部分的研究都是著重于檢測(cè)BPDE的DNA﹑蛋白加合物或BPDE加合物的水解產(chǎn)物進(jìn)行定性，定量分析，這些方法前處理步驟繁多致使BPDE加合物的回收率低。因此如果能夠選擇直接BPDE，不僅簡(jiǎn)單易行，可以提供個(gè)體“內(nèi)接觸”量或“有效接觸”量，還能提供化學(xué)毒物的代謝活化信息。 在本研究中，采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)和熒光檢測(cè)法對(duì)BPDE標(biāo)準(zhǔn)品溶液及細(xì)胞液中的BPDE進(jìn)行檢測(cè)，為進(jìn)一步研究BPDE的定性和定量分析奠定基礎(chǔ)；用

6、單細(xì)胞凝膠電泳方法檢測(cè)了BPDE對(duì)體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞的DNA損傷，以期反映BPDE對(duì)遺傳物質(zhì)的損傷；最后是對(duì)B(a)P的原型消減進(jìn)行探索性研究，用B(a)P單獨(dú)染毒或B(a)P與PCB153聯(lián)合染毒HepG2細(xì)胞，然后用HPLC-UVD﹑FD檢測(cè)經(jīng)HepG2細(xì)胞代謝后細(xì)胞中的B(a)P的濃度，探索PCB153在B(a)P代謝過(guò)程中的作用。 第一部分、B(a)P代謝產(chǎn)物BPDE的檢測(cè)技術(shù)。 1. B(a)P代謝產(chǎn)物B

7、PDE的HPLC－紫外檢測(cè)技術(shù)。 采用高效液相色譜－紫外測(cè)定的方法檢測(cè)BPDE標(biāo)準(zhǔn)品溶液及在細(xì)胞液中的BPDE。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：BPDE標(biāo)準(zhǔn)品在DMSO溶液中的濃度與其峰面積呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為Y=637138X-124587，R2=0.9982。BPDE標(biāo)準(zhǔn)品在濃度1.00～20.00μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，該方法的最低檢出限為0.0625μg/ml。BPDE標(biāo)準(zhǔn)品在細(xì)胞裂解液中的線性回歸方程為Y=42

8、4298X＋24598，R2=0.9921。本方法的日內(nèi)精密度RSD 2.9～3.6％和日間精密度RSD 4.3～5.9％。BPDE化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，對(duì)光，濕度及酸很敏感。在同樣的濃度下，BPDE標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞裂解液中的BPDE標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積出現(xiàn)差異，經(jīng)過(guò)分析，在細(xì)胞裂解液中的BPDE的含量偏低，但顯著高于在環(huán)境中的自然變化。 2. B(a)P代謝產(chǎn)物BPDE的HPLC－熒光檢測(cè)技術(shù)。 采用高效液相色譜－熒光測(cè)定方法檢測(cè)B

9、PDE標(biāo)準(zhǔn)品溶液及在細(xì)胞液中的BPDE。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：BPDE標(biāo)準(zhǔn)品在DMSO溶液中的濃度與其峰面積呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為Y=2E+07X+178569，R2=0.9988。BPDE標(biāo)準(zhǔn)品在濃度0.01～1.00μg/ml范圍時(shí)具有良好的線性關(guān)系，該方法的最低檢出限為0.005μg/ml。本方法的日內(nèi)精密度RSD 3.2～4.6％和日間精密度RSD 5.9～7.4％。在同樣的濃度下，BPDE標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞裂解液中的BPDE標(biāo)準(zhǔn)

10、品的峰面積出現(xiàn)差異，經(jīng)過(guò)分析，在細(xì)胞裂解液中的BPDE的含量偏低，但顯著高于在環(huán)境中的自然變化。 第二部分、BPDE致HepG2細(xì)胞DNA損傷的毒理學(xué)研究。 用0.05μmol/L，0.1μmol/L，0.5μmol/L，1μmol/L，2μmol/L5個(gè)不同濃度的BPDE染毒體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞，用50μmol/LB(a)P做陽(yáng)性對(duì)照，采用單細(xì)胞凝膠電泳的方法檢測(cè)BPDE對(duì)HepG2細(xì)胞的DNA損傷。結(jié)果顯示，在本

11、實(shí)驗(yàn)中不同濃度的BPDE染毒組與正常組相比Olive尾矩均有顯著性差異(P＜0.01),而不同濃度組之間差異也有顯著性(P＜0.01),BPDE最高濃度組與B(a)P陽(yáng)性對(duì)照組相比也有顯著性差異(P＜0.01)，隨著B(niǎo)PDE濃度的增加，HepG2細(xì)胞的Olive尾矩值逐漸增大，并呈明顯的劑量-依賴(lài)關(guān)系。這說(shuō)明反式BPDE可引起DNA斷裂損傷,且損傷程度與染毒劑量有關(guān)。 第三部分、苯并(a)芘原型代謝消減的探索性研究。 用

12、50μmol/L B(a)P對(duì)HepG2細(xì)胞單獨(dú)作用72個(gè)小時(shí)或先用不同濃度(0.1μmol/L，1μmol/L，10μmol/L，100μmol/L)PCB153對(duì)HepG2細(xì)胞預(yù)處理48個(gè)小時(shí)然后再與50μmol/L B(a)P聯(lián)合作用24個(gè)小時(shí)，采用HPLC-UVD﹑FD檢測(cè)HepG2細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)代謝后的B(a)P的濃度。結(jié)果顯示，PCB153在低濃度0.1μmol/L和1μmol/L與B(a)P聯(lián)合作用時(shí)，在HepG2細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到

13、的B(a)P濃度要高于B(a)P單獨(dú)作用的濃度，且隨著PCB153濃度的增高，在HepG2細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到的B(a)P濃度有增高的趨勢(shì)。但是在PCB153的濃度為10μmol/L和100μmol/L時(shí)，它與B(a)P的聯(lián)合作用后在HepG2細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到的B(a)P濃度要低于B(a)P單獨(dú)作用的濃度，且隨著PCB153濃度的增高，在HepG2細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到的B(a)P濃度呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)。由此推測(cè)PCB153在誘導(dǎo)P450酶活性時(shí)可能存在一定的