TRP-2-,(180-188)-CTL表位之APL的設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià).pdf

1、 通過(guò)替換MHC結(jié)合位點(diǎn)(錨固性殘基)是提高表位免疫原性最常用的方法之一。其原理是：雖然T細(xì)胞受體(Tcellreceptor，TCR)對(duì)MHC-Ⅰ類限制性表位的識(shí)別是特異性的，但這種特異性不是指一個(gè)TCR只能與單一的肽段結(jié)合，而是指一個(gè)T細(xì)胞受體可以識(shí)別一系列具有某些共同特性的肽段，其中包括一些經(jīng)過(guò)修飾的非天然肽段，即修飾的肽配體(alteredpeptideligand，APL)。APL與T淋巴細(xì)胞相互作用后會(huì)誘發(fā)不同的效應(yīng)：

2、增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞活化(激動(dòng)劑，agonist)或抑制T淋巴細(xì)胞活化(拮抗劑，antagonist)。因此，對(duì)于免疫原性較低的腫瘤抗原表位肽，通過(guò)特定氨基酸位點(diǎn)的修飾可以找到某些具有活化T細(xì)胞作用的表位肽，達(dá)到增強(qiáng)免疫原性的目的，從而誘發(fā)比天然肽更強(qiáng)的CTL反應(yīng)。在以往的研究中，黑色素瘤分化抗原MART1/MelanA(27-35)(AAGIGILTV)1L、gp100(209-217)(ITDQVPFSV)2M和癌胚抗原CAP-1(YLS

3、GANLNL)6D3條agonists均已應(yīng)用于臨床試驗(yàn)，并觀察到較好的臨床療效。 TRP-2，即酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2，是一種腫瘤相關(guān)抗原，與gp100、MART1/MelanA同屬于非變異的黑色素瘤細(xì)胞分化抗原。TRP-2抗原不但在黑色素瘤廣泛表達(dá)，在多形性惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)率為51.2％，TRP-2(180-188)(SVYDFFVWL)表位在人和小鼠的黑色素瘤細(xì)胞和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞均能被遞呈。因此TRP-2(180-188

4、)是針對(duì)黑色素瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤免疫學(xué)治療的理想靶標(biāo)。但TRP-2(180-188)天然表位與前述的3條agonists的天然表位一樣，在黑色素瘤病人體內(nèi)存在大量的表位特異性CTL前體，但這些T細(xì)胞卻處于免疫耐受狀態(tài)。因此，將TRP-2(180-188)天然表位特定位點(diǎn)氨基酸加以修飾，增強(qiáng)該表位的免疫原性，就可能誘發(fā)強(qiáng)有力的CTL反應(yīng)，從而打破機(jī)體對(duì)腫瘤抗原表位的耐受，逆轉(zhuǎn)在體低親和力CTL“無(wú)能”狀態(tài)，提高天然表位的抗腫瘤效果。

5、在本實(shí)驗(yàn)中，首先用MHC分子主要和次要錨著位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)氨基酸替換TRP-2(180-188)(SVYDFFVWL)相應(yīng)位點(diǎn)：P1位用Y，P2位用L或M分別或同時(shí)替換天然表位的相應(yīng)位點(diǎn)。通過(guò)多項(xiàng)式方案、量化基序和QSAR方案評(píng)測(cè)APLs的MHC親和力，并對(duì)APLs與HLA-A*0201分子的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子模擬研究，從中篩選出4條MHC親和力較高的APLs合成、純化和鑒定，4條APLs的氨基酸序列為：TRP-22L(SLYDFFVWL)、T

6、RP-22M(SMYDFFVWL)、TRP-21Y2L(YLYDFFVWL)、TRP-21Y2M(YMYDFFVWL)。在體外采用經(jīng)典的T2/肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)和多肽/MHC復(fù)合物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)APLs與HLA-A*0201分子的結(jié)合能力。經(jīng)典的T2/肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：4條APLs的MHC結(jié)合親和力均高于天然表位，各肽的MHC親和力(H值)由高到低為：TRP-22L(2.49)；TRP-22M(2.15)；TRP-21Y2M(1.82)；TR

7、P-21Y2L(1.45)；天然表位(1.32)。多肽/MHC復(fù)合物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：經(jīng)BFA處理后，各肽的多肽/MHC復(fù)合物6h保持率由高到低為：TRP-22M(80％)；TRP-21Y2M(71％)；TRP-21Y2L(69％)；天然表位(56％)；TRP-22L(53％)。 CTLs的功能通常用兩方面評(píng)價(jià)：一是檢測(cè)其分泌細(xì)胞因子的能力，比如IFN-γ；另一條途徑是檢測(cè)其細(xì)胞毒效應(yīng)，顆粒酶B的釋放是CTL和NK細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞

8、毒效應(yīng)的一個(gè)重要武器，因此檢測(cè)顆粒酶B的釋放可以代表表位特異CTL的細(xì)胞毒作用。在本研究中，我們采用了高靈敏度的ELISPOT法來(lái)檢測(cè)表位特異性CTLs分泌細(xì)胞因子的能力和釋放顆粒酶B的細(xì)胞毒效應(yīng),用APLs在體外刺激健康人PBMC，誘導(dǎo)出表位特異性的CTLs。對(duì)這些CTLs的ELISPOT檢測(cè)結(jié)果表明，與天然多肽相比，TRP-22M特異的CTLs能識(shí)別負(fù)載天然表位的T2細(xì)胞，并分泌較高水平的IFN-γ和顆粒酶B；但TPR-22M特異性

9、的CTL在識(shí)別腫瘤細(xì)胞株LB373-MEL(HLA-A*0201+，TRP-2+)時(shí)，其分泌顆粒酶B的水平與天然多肽或其余3條APLs特異性的CTLs無(wú)明顯差異。在體免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)采用HLA-A*0201/Kb轉(zhuǎn)基因鼠，用PADRETh表位輔助APLs免疫小鼠。11天后取出脾細(xì)胞，體外用相應(yīng)表位肽刺激5天后作效應(yīng)細(xì)胞，用于小鼠的IFN-γELISPOT檢測(cè)。結(jié)果顯示，與天然表位和其他APLs相比，TRP-22M誘導(dǎo)的CTL能識(shí)別負(fù)載天然表位

10、的T2細(xì)胞，且分泌IFN-γ的能力最強(qiáng)，其在體免疫原性顯著增強(qiáng)。 綜上所述，與天然表位相比，TRP-22M能形成更穩(wěn)定的多肽/MHC復(fù)合物，在體內(nèi)和體外免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中，TRP-22M較天然表位活化CTL的能力顯著提高，能誘發(fā)比天然肽更強(qiáng)的CTL反應(yīng)等免疫學(xué)效應(yīng)，由此可以推測(cè)：TRP-22M增強(qiáng)的免疫學(xué)效應(yīng)可能與其較強(qiáng)的MHC結(jié)合穩(wěn)定性相關(guān)。在后續(xù)的研究中將進(jìn)一步驗(yàn)證TRP-22M對(duì)其他TRP-2+腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)和應(yīng)用于黑色素瘤