HBV相關(guān)抗原HLA-A3超型CTL表位肽預(yù)測與鑒定.pdf

1、研究背景：由乙型肝炎病毒（HBV）引起的慢性乙型肝炎是我國常見的慢性傳染病之一，嚴(yán)重危害人民健康。以往研究表明，抗原特異性的CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）對體內(nèi)HBV的清除起關(guān)鍵作用。在乙肝患者體內(nèi)，來源于HBV 相關(guān)抗原的、MHC-I 類分子限制性表位肽被認(rèn)為是特異性CD8+CTL 識別病毒感染細(xì)胞的靶標(biāo)。雖然慢性HBV 感染患者外周血中存在抗原肽特異性CTL，但這種病毒特異性CD8

2、+CTL的頻率及功能減低，是HBV 得以持續(xù)存在的一個重要原因。
　　 因此，通過主動免疫方式增強HBV 相關(guān)抗原肽特異性CTL 反應(yīng)，是治療慢性HBV感染的理想策略。既往對于病毒抗原表位肽的研究多針對單一主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex, MHC）限制性，缺乏覆蓋更多人白細(xì)胞抗原（humanleucocyte antigen，HLA）背景人群的治療性表位肽疫苗。HLA分子的

3、高度多態(tài)性與T細(xì)胞識別的MHC 限制性是研制廣譜高效表位肽疫苗的最大障礙。HLA 超型是指具有相同的肽結(jié)合特異性的不同HLA分子的總合。這一概念的提出，為基于HBV 相關(guān)抗原超型表位肽疫苗的設(shè)計提供了新的思路。
　　 研究目的：本研究初步分析了慢性HBV 感染與HLA-A 超型的相關(guān)性，預(yù)測并初步鑒定了HLA-A3 超型限制性HBV 相關(guān)抗原特異性CTL表位肽，為基于超型表位的慢性HBV 感染的治療提供實驗基礎(chǔ)及新的候選靶標(biāo)。<

4、br>　　 研究方法：分別從西南醫(yī)院肝炎門診和獻(xiàn)血中心收集慢性HBV 感染者及健康志愿者外周血，通過聚合酶鏈反應(yīng)/序列特異性引物技術(shù)（PCR-SSP）對其HLA 型別進(jìn)行檢測，分析慢性HBV 感染與HLA-A 超型之間的關(guān)系?；赟YFPEITHI、BIMAS、SVMHV、IEDB、EPIJEN、NETMHC 6個表位預(yù)測網(wǎng)站，分別預(yù)測出HLA-A3 超型各等位基因（HLA-A*0301、HLA-A*1101、HLA-A*3101、H

5、LA-A*3301、HLA-A*6801）
　　 限制性表位，并對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行整合，預(yù)測出與HLA-A3 超型各等位基因具有高親和力的乙肝表面抗原（HBsAg）和乙肝核心抗原（HBcAg）候選表位肽。鑒于HLA 超型分子具有結(jié)合相同或相似表位肽的特點，并且在HLA-A3 超型中，HLA-A*1101分子表型頻率最高，因此，我們選擇首先鑒定候選超型表位肽HLA-A*1101限制性。在體外細(xì)胞功能試驗中，通過Elispot Assa

6、y 檢測候選表位肽誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞（PBMC）IFN-γ的分泌；胞內(nèi)因子染色流式細(xì)胞術(shù)分析表位肽特異性CD8+CTL IFN-γ及GranB的分泌；CFSE 標(biāo)記檢測表位肽誘導(dǎo)的特異性CD8+CTL的增殖；Pentamer染色流式細(xì)胞術(shù)分析法檢測HLA-A*1101健康志愿者PBMC經(jīng)肽誘導(dǎo)后所產(chǎn)生的特異性CD8+CTL 頻率，以及慢性HBV 感染患者外周血表位肽特異性CD8+CTL的頻率。
　　 最后通過Elispot as

7、say 初步鑒定候選表位肽對其他HLA-A3 超型等位基因的健康人PBMC 所產(chǎn)生的誘導(dǎo)效應(yīng)。
　　 研究結(jié)果：在我們收集的44例來自西南醫(yī)院獻(xiàn)血中心的健康志愿者中，HLA-A3超型為主要HLA-I 類分子超型基因，其中以HLA-A*1101頻率最高，在49例慢性HBV感染者中，HLA-A2 超型為最高頻超型等位基因。結(jié)合多個在線表位預(yù)測網(wǎng)站，采用整合法預(yù)測的超型表位兼顧了與HLA-A3 超型全部等位基因具有高親和力的表位（P5

8、,P6, P7, P8, P9）。根據(jù)應(yīng)答指數(shù)以及胞內(nèi)因子染色結(jié)果證實五條候選表位肽均能在體外誘導(dǎo)HLA-A*1101健康人外周血表位肽特異性CD8+CTL 增殖并分泌IFN-γ和GranB。在HLA-A*1101陽性的慢性HBV 感染患者中，P7 肽誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性CD8+CTL 頻率明顯高于已知的陽性表位P6 肽。五條候選超型表位肽均可以誘導(dǎo)帶有HLA-A3 超型等位基因個體的PBMC分泌IFN-γ,但是對同屬于HLA-A3 超型的

9、不同HLA等位基因，其限制性CTL分泌IFN-γ的能力存在差異。
　　 研究結(jié)論：結(jié)合本研究中各部分的實驗結(jié)果，HLA-A3 超型在人群中分布頻率最高，同時，HLA-A*1101是HLA-A3 超型中最高頻等位基因。利用整合法預(yù)測的5 條HBV 相關(guān)抗原候選表位，經(jīng)初步鑒定為HLA-A3 超型限制性CTL表位。而且，從表位肽特異性CTL的頻率與功能水平上分析，較目前已知的HLA-A*1101限制性陽性表位肽（P6），P7 肽是一