心肌肥厚和TRP通道基因表達(dá)的研究.pdf

1、心肌肥厚是多種心臟疾病共同的病理過程。其病理變化包括心肌細(xì)胞肥大、心肌間質(zhì)細(xì)胞增殖以及心臟細(xì)胞外基質(zhì)改建等多方面的改變,即心肌重構(gòu)。心肌肥厚時(shí)心肌細(xì)胞蛋白合成增加、體積增大、直徑增寬或長(zhǎng)度增加,肌節(jié)數(shù)量增多并伴有纖維組織增生。心肌肥厚是引起多種心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。早期的心肌肥厚可能是心肌細(xì)胞對(duì)外界的刺激的一種適應(yīng)性的改變,有一定的代償意義,有利于維持心輸出量,以滿足機(jī)體的需要,但是長(zhǎng)期的心肌肥厚最終會(huì)導(dǎo)致心力衰竭,甚至?xí)?。在?/p>

2、肌肥厚發(fā)生發(fā)展過程中,細(xì)胞內(nèi)鈣內(nèi)流都起到了至關(guān)重要的作用。當(dāng)壓力負(fù)荷作用與心臟或者是某些神經(jīng)體液因子(AngⅡ、ET-1和PE等)刺激時(shí),可以導(dǎo)致細(xì)胞膜上鈣庫(kù)調(diào)控的鈣通道(SOC)、受體調(diào)控的鈣通道(ROC)或者電壓依賴的鈣通道(VDCC)等通道開放,使鈣離子內(nèi)流,細(xì)胞內(nèi)鈣會(huì)和鈣調(diào)素(CaM)結(jié)合,繼而激活鈣調(diào)磷酸酶(CaN),CaN的活化,又作用于NFAT通路,導(dǎo)致肥大基因的表達(dá)升高,進(jìn)而引起心肌肥厚。
　　 TRP通道是存在

3、與細(xì)胞膜上一種重要的陽(yáng)離子通道,與眾多的疾病的發(fā)生發(fā)展有重要的關(guān)系,TRP通道幾乎存在與機(jī)體的各個(gè)組織。在心臟中主要是表達(dá)的是TRPC通道,也表達(dá)部分TRPM和TRPV通道。大多數(shù)的TRP通道都可以使鈣通過。此外ROC、VDCC和SOC的開放,也可以導(dǎo)致鈣內(nèi)流。而TRPC通道的部分亞型被認(rèn)為是組成ROC或者SOC的分子基礎(chǔ)。ROC和SOC等都與鈣內(nèi)流有關(guān),與心肌肥厚的發(fā)生密切相關(guān)。因而’TRPC通道和心肌肥厚的發(fā)生有很重要的關(guān)系。但是,

4、目前為止,對(duì)于TRP通道和心肌肥厚的關(guān)系,TRPC通道的報(bào)道較多,其他的TRP通道的亞型報(bào)道較少,其在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中是否發(fā)揮作用尚未知曉,有待于進(jìn)一步研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用Real-Time PCR的方法去研究TRPC、TRPV、TRPM、STIM1和Orai1在正常成年大鼠、新生期大鼠和心肌肥厚模型組大鼠的心肌組織中表達(dá)水平。通過與正常成年大鼠心肌組織的表達(dá)水平的比較,研究這些通道和心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的關(guān)系;另外,通過新

5、生期大鼠和正常成年大鼠和心肌肥厚模型大鼠的比較,也可以了解心臟發(fā)育與心肌肥厚的關(guān)系。
　　 第一部分大鼠心肌肥厚模型的制備和心臟功能和組織學(xué)評(píng)價(jià)
　　 目的:制各異丙腎上腺素(Iso)誘導(dǎo)和腹主動(dòng)脈縮窄(AAC)誘導(dǎo)的心肌肥厚模型。
　　 方法:Iso誘導(dǎo)心肌肥厚模型:Iso5mg/(kg·d),背部皮下注射,連續(xù)七天,可以誘導(dǎo)大鼠心肌肥厚模型;AAC誘導(dǎo)的心肌肥厚模型:大鼠常規(guī)1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,左側(cè)臥

6、位,切開皮膚、筋膜和肌肉,游離出一段腹主動(dòng)脈,然后用4?？p合線將自制的彎曲的8＃針頭和該段腹主動(dòng)脈一起結(jié)扎,再緩慢的抽出針頭,造成腹主動(dòng)脈在結(jié)扎點(diǎn)處內(nèi)徑縮窄,然后依次復(fù)位各臟器,縫合腹壁。關(guān)籠飼養(yǎng),常規(guī)給予16萬U青霉素抗炎一周。飼養(yǎng)十二周成模。
　　 結(jié)果:血流動(dòng)力學(xué):與空白對(duì)照組比較,Iso模型組和AAC組INEDP明顯升高(P＜0.01),而LVSP和±dp/dtmax明顯下降(P＜0.01)。Iso組和AAC組兩組相比,

7、LVEDP、LVSP、±dp/dtmax則無明顯差異(P＞0.05)。心臟重量指數(shù)(HWI):與空白對(duì)照組比較,Iso模型組和AAC組心臟重量及HWI明顯升高(P＜0.01);病理學(xué)檢查:光鏡下可見,空白對(duì)照組大鼠心肌纖維排列整齊,橫紋明顯,胞核結(jié)構(gòu)清晰,無細(xì)胞腫脹;Iso組和AAC組心肌細(xì)胞顯著肥大,核大濃染,肌纖維排列紊亂,呈旋渦狀或簇狀,肌原纖維走向不一,互相交錯(cuò)排列。
　　 結(jié)論:經(jīng)過Iso處理和AAC處理的大鼠均能成功

8、誘導(dǎo)出心肌肥厚,其中Iso造模方法相對(duì)簡(jiǎn)單,成模率高;AAC模型類似臨床負(fù)荷性心肌肥厚的病理生理學(xué)過程。兩種方法誘導(dǎo)的心肌肥厚模型成功制備下一步的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
　　 第二部分心肌肥厚與TRIP離子通道基因表達(dá)水平的研究目的:研究正常成年大鼠、新生期大鼠、心肌肥厚模型組大鼠心肌組織中TRP通道、STIM1和Orai1 mRNA的表達(dá)水平。
　　 方法:嚴(yán)格按照Promega total RNA Isolation Sye

9、tem的方法分別提取正常成年大鼠、新生期大鼠和模型組大鼠的心肌組織的總RNA;然后根據(jù)Promega Reverse Transcription System的方法合成cDNA的第一鏈;最后根據(jù)Takara SYBR Premix Ex TaqTM熒光試劑盒的說明和cDNA的量,進(jìn)行Real-Time PCR。數(shù)據(jù)分析所用的方法為2-△Ct,其中-△Ct為不同組間PCR擴(kuò)增進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期的循環(huán)數(shù)的差值。
　　 結(jié)果:
　　

10、 1.BNP是心肌肥厚的標(biāo)記分子之一,與正常成年鼠相比,在Iso誘導(dǎo)的心肌肥厚和AAC誘導(dǎo)的心肌肥厚模型的心肌組織中,BNP的mRNA表達(dá)水平分別升高了7.80±0.33倍和8.11±0.37倍(P＜0.01),而新生期大鼠的心肌組織中BNP的表達(dá)水平升高了8.08±0.39倍(P＜0.01)。
　　 2.TRPC1、TRPC3和TRPC6通道m(xù)RNA在心肌肥厚模型和新生期大鼠的心肌組織中表達(dá)水平均升高(P＜0.01,數(shù)據(jù)未列

11、出,詳見第二部分Table3和Table4)。上述三個(gè)通道在Iso誘導(dǎo)心肌肥厚模型和AAC誘導(dǎo)的心肌肥厚模型的表達(dá)水平無差異(P＞0.05)。TRPC2、TRPC4和TRPC5通道在三組中的表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05)。TRPC7在新生期大鼠的表達(dá)水平要高于其他三組(P＜0.01)。正常成年大鼠和模型組大鼠TRPC7的表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05)。
　　 3.在正常成年大鼠組、新生期大鼠組和心肌肥厚模型組大鼠的心肌組

12、織中只探測(cè)到了TRPM4和TRPM7有表達(dá),其他的TRPM通道均未探測(cè)到。其中TRPM4在新生期大鼠組和心肌肥厚模型組的表達(dá)水平要高于正常成年大鼠組(P＜0.01,詳見第二部分Table5和Table6)。在所有組的心肌組織中TRPM7表達(dá)水平無明顯差異。
　　 4.在正常成年大鼠組、新生期大鼠組和心肌肥厚模型組大鼠組的心肌組織中只探測(cè)到了TRPV2和TRPV6有表達(dá),其他的TRPV通道均未探測(cè)到。TRPV2和TRPV6主要在心

13、肌成纖維細(xì)胞上有表達(dá)。和正常成年大鼠組相比,心肌肥厚模型組的TRPV2和TRPV6表達(dá)水平均升高(P＜0.01,詳見第二部分Table5和Table6)。正常成年大鼠和新生期的大鼠表達(dá)水平則無差異。
　　 5.與正常成年大鼠相比,新生期大鼠和心肌肥厚模型組大鼠的心肌組織中STIM1和Orai1的表達(dá)水平均升高(P＜0.01,詳見第二部分Tablel和Table2)。
　　 結(jié)論:在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過程中,TRP通道的亞