青島文昌魚(yú)TRP14和ycaCR基因的表達(dá)和功能鑒定.pdf

1、中國(guó)海洋大學(xué)博士學(xué)位論文青島文昌魚(yú)TRP14和ycaCR基因的表達(dá)和功能鑒定姓名：蔣圣娟申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)指導(dǎo)教師：張士璀20070601中國(guó)海洋大學(xué)博i學(xué)位論文異性。利用Amphi—l’RPl4原核表達(dá)重組蛋白質(zhì)制備的多克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)雜交，發(fā)現(xiàn)在蛋白水平也存在類(lèi)似的表達(dá)分布，而人類(lèi)TRPl4蛋白分布于所有組織內(nèi)，呈現(xiàn)廣泛表達(dá)的模式，這說(shuō)明AmphiTRPl4蛋白在這些組織的高表達(dá)可能和其易于被氧化壓力的損害有

2、關(guān)或者是在食物消化過(guò)程中起特殊的作用。本文還報(bào)道一個(gè)類(lèi)ycaC的基因AmphiycaCR，這是在除大腸桿菌以外的物種中首次報(bào)道。它全長(zhǎng)891bp，最人開(kāi)放閱讀框編碼由201個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其理論分子量大約為22KDa，理論等電點(diǎn)為72。AmphiycaCR含有一個(gè)保守的ycaC—related的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，且含有保守的可能的催化殘基D19、R(K184和cll8(1YAC；按大腸桿菌ycaC中標(biāo)號(hào))和保守的非脯氨酸的順式肽鍵，并

3、且具有與ycaC蛋白相類(lèi)似的三層三明治拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，這是ycaC家族的典型特征。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，AmphiycaCR蛋白單獨(dú)聚類(lèi)，與Isochorismatase超家族的其他亞家族明顯分開(kāi)，說(shuō)明AmphiycaCR與ycaC雖然有類(lèi)似的殘基，但分屬不同的亞家族。從佛歲里達(dá)文昌魚(yú)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中也搜索到y(tǒng)caCR基因，和青島文昌魚(yú)ycaCR氨基酸同源性達(dá)93％，其基因組序列包含四個(gè)外顯子和j個(gè)內(nèi)含子，后口動(dòng)物包括人、大鼠和狗的ycaCR基因結(jié)

4、構(gòu)含有五個(gè)外顯子和四個(gè)內(nèi)含子，原口動(dòng)物如果蠅和線蟲(chóng)ycaCR基因則含有三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子，說(shuō)明存物種進(jìn)化過(guò)程中，該基因外顯子呈現(xiàn)增多趨勢(shì)。應(yīng)用原核蛋白表達(dá)的方法構(gòu)建原核表達(dá)載體，純化融合蛋白AmphiycaCR。用Isochorismatase，Nocitinamidase和Ncarbamoylsarcoslneamidohydrolase活性測(cè)定方法測(cè)定AmphiycaCR的活性，發(fā)現(xiàn)AmphiycaCR不具有這三種酶的活性。蛋白

5、質(zhì)互作實(shí)驗(yàn)鑒定了兩種相互作用蛋白，一個(gè)是文昌魚(yú)組織液巾正常含有的ycaCR蛋白，說(shuō)明文昌值ycaCR蛋白可能是以同源多聚體發(fā)揮生理功能；另一個(gè)是肌酸激酶，可能通過(guò)相互結(jié)合問(wèn)接參與能量反應(yīng)。AmphiycaCR切片原位雜交表明AmphiycaCR在成體文昌魚(yú)不同組織中表達(dá)量變化較大，在肝旨囊、腸、內(nèi)柱和卵巢表達(dá)量較高，其他組織表達(dá)量較低，呈現(xiàn)完全表達(dá)摸式。制備多克隆抗體，并應(yīng)用于免疫組織化學(xué)定位，研究結(jié)果‘j切片原位雜交結(jié)果。致。結(jié)果說(shuō)明