培養(yǎng)的哮喘豚鼠氣道平滑肌細(xì)胞ryanodine受體內(nèi)鈣釋放功能的改變及其mRNA表達(dá)的變化.pdf

1、哮喘是一種世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康的慢性炎癥性疾病。其發(fā)病機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，諸多因素參與其中。近年來，人們逐漸認(rèn)識(shí)到氣道平滑肌細(xì)胞(airwaysmooth muscle cellsASMCs)在介導(dǎo)哮喘的發(fā)病機(jī)制中起到了重要作用，而鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使參與調(diào)節(jié)了ASMCs的許多重要功能。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca<'2+>]i)升高在介導(dǎo)哮喘的氣道高反應(yīng)性，氣道重構(gòu)以及氣道炎癥中起到了非常關(guān)鍵的作用。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高主要通過

2、外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放兩種途徑實(shí)現(xiàn)。目前，對外鈣內(nèi)流與哮喘關(guān)系的研究較為深入，臨床上已有應(yīng)用鈣拮抗劑，通過抑制ASMCs的外鈣內(nèi)流治療哮喘。而對內(nèi)鈣釋放的研究相對較少。ASMCs中存在三磷酸肌醇受體(IP3R)和Ryanodine受體/鈣通道(RyRs)兩種內(nèi)鈣釋放通道。有研究發(fā)現(xiàn)，IP3R和RyRs參與乙酰膽堿誘導(dǎo)引起的平滑肌細(xì)胞內(nèi)重復(fù)持續(xù)的鈣濃度改變。這種改變不能由IP3單獨(dú)啟動(dòng)且不能被IP3R抑制劑完全抑制，但可被RyRs抑制劑完全抑

3、制。本研究正是基于此點(diǎn)，制備卵蛋白誘導(dǎo)的哮喘豚鼠模型，分離培養(yǎng)其ASMCs，通過測定ASMCs內(nèi)鈣離子濃度的改變，并從分子水平研究ASMCs中RyRs各亞型mRNA的表達(dá)情況，比較正常和支氣管哮喘時(shí)的差異，以此提供哮喘發(fā)病的理論依據(jù)，也為開發(fā)治療哮喘的藥物提供新的作用靶點(diǎn)。同時(shí)，嘗試傳代培養(yǎng)哮喘豚鼠ASMCs，比較傳代與原代培養(yǎng)的ASMCs中RVRs內(nèi)鈣釋放通道的改變，探索獲得具有“哮喘”特性ASMCs的方法。 實(shí)驗(yàn)材料和方法:

4、 1、材料 膠原酶(日本制藥株式會(huì)社)，雞卵清白蛋白(美國Sigma公司)，ryanodine(美國Sigma公司)，組織胺(histamine)(上海生化研究所)，DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(天津市生化制品廠)，F(xiàn)lou-3/AM，EGTA和HEPES(美國Sigma公司)，平滑肌特異α-肌動(dòng)蛋白抗體(武漢博士德生物工程公司)，F(xiàn)ITC(中國醫(yī)科大學(xué)免疫教研室贈(zèng))。RT-PCR試劑盒(TaKaRa公

5、司)。Trizol reagent(美國Gibco公司)。 健康雄性豚鼠，體重0.3～0.4Kg。中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。 2、方法 豚鼠哮喘模型的制備：健康雄性豚鼠，體重0.3～0.4Kg。中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。將豚鼠隨機(jī)分成空白對照組和哮喘組。哮喘組豚鼠腹腔注射10％卵蛋白生理鹽水溶液1mL，于第14天開始隔天超聲霧化吸入1％卵蛋白，每次2min，激發(fā)7次，觀察動(dòng)物狀態(tài)。動(dòng)物逐漸出現(xiàn)呼吸加快，最后出

6、現(xiàn)腹式呼吸，提示造模成功。對照組采用生理鹽水霧化吸入，液體容積與哮喘組相同。 豚鼠ASMCs的分離培養(yǎng)：單只豚鼠擊頭處死，無菌取其全部主氣管。冰浴條件下，分離其外周結(jié)締組織及脂肪組織，剪開其軟骨面，用棉簽輕輕刮除氣管粘膜及粘膜下層后，分離兩側(cè)的軟骨，將分離的平滑肌束切成1 mm×1 mm×1 mm小塊，以0.2％膠原酶37℃、通氣(95％O2和5％CO2)的條件下，消化2次，每次40 min，而后沖洗、穩(wěn)定、吹打、過濾離心后將細(xì)

7、胞接種于培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶中，以含20％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，取培養(yǎng)的第5-7天細(xì)胞用于測鈣，待細(xì)胞培養(yǎng)至80％融合進(jìn)行收集，用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。 豚鼠ASMCs的鑒定：肌動(dòng)蛋白熒光抗體檢測豚鼠ASMCs。 [Ca<'2+>]i的測定：Fluo-3/AM的準(zhǔn)備：細(xì)胞內(nèi)鈣熒光指示劑采用Fluo-3/AMl：200體積比將1mMFluo-3/AM用D-Hanks稀釋為終濃度5×10<'-6>mol·L<'-1>

8、，加入貼壁培養(yǎng)ASMCs的培養(yǎng)皿中負(fù)載。置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中避光孵育30～60min，而后用PBSNb洗2次后，穩(wěn)定15min，用倒置熒光顯微鏡及高靈敏度冷CCD數(shù)碼攝像機(jī)采集細(xì)胞熒光圖象，激發(fā)光波長488nm，發(fā)射光波長為528nm。應(yīng)用Metafluo4.5分析軟件進(jìn)行圖像處理時(shí)，對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行圖像分析。鈣離子濃度的變化用△F/F<,0>的比值來表示，F(xiàn)<,0>為基礎(chǔ)熒光密度值，F(xiàn)為給予不同工具藥后細(xì)胞的熒光密度值，△F/

9、F<,0>=(F-F<,0>)/F<,0>代表給藥后鈣離子的變化程度。豚鼠腦、骨骼肌和心肌的取材：豚鼠擊頭處死，無菌條件下迅速取骨骼肌、心肌和小腦組織分別作為RyR1、Ryg2和RyR3的陽性對照，取出后的組織部分放入2 ml無菌Eppendof管中，向管內(nèi)加入1 ml Trizol，用勻漿器充分勻漿后進(jìn)行RNA提取。余下部分凍存于．70℃冰箱。 豚鼠ASMCs中RyRs各亞型的mRNA表達(dá)：Trizol法提取總RNA，紫外分光

10、光度計(jì)測RNA的純度及濃度，然后進(jìn)行cDNA的合成。引物序列是根據(jù)小鼠和大鼠的RyR1，Ryg2和RyR3的cDNA設(shè)計(jì)的。 各引物序列為RyR1：上游引物5’-GAAGGTTCTGGACAAACACGGG-3’，下游引物5’-TCGCTCTTGTTGTAGAATTTGCGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物435 bp；RyR2：上游引物5’-GAATCAGTGAGTTACTGGGCATGG-3’，下游引物5’-CTGGTCTCTGAGTTCT

11、CCAAAAGC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物635 bp；RyR3：上游引物5’-CCTTCGCTATCAACTTCATCCTGC-3’，下游引物5’-TCTTCTACTGGGCTAAAGTCAAGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物505 bp。β-actin：上游引物5’-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3’. 下游引物5’-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物300 bp。 引物由TaKaRa公司合成。以β-act

12、in為內(nèi)參。反轉(zhuǎn)錄體系為：總RNAlμg，參照試劑盒的說明加入其它試劑，最后為10 μl體系。反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR．反應(yīng)體系：5×PCR緩沖液10 μl，Taq酶0.25μl，上游和下游引物各為1 μl，加無菌水補(bǔ)足體積50μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，以94℃30 s，58℃30s，72℃2 min的順序，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min，產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照、分析。

13、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 11.5，用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，P<0.01。全部數(shù)據(jù)均表示為x±s。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1、在ASMCs外無鈣情況下，不同濃度ryanodine(5×10<'-5>mol·L<'-1>，10<'-4>mol·L<'-1>，2×10<'-4>mol·L<'-1>)作用于原代培養(yǎng)正常與哮喘豚鼠ASMCs，[Ca<'2+>]i迅速升高，哮喘組明顯高于正常

14、組(P<0.01)。10<'-4>mol·L<'-1>的組織胺(histamine)作用于原代培養(yǎng)的正常組與哮喘組ASMCs，[Ca<'2+>]i升高無明顯差異(P>0.05)。 2、傳代培養(yǎng)哮喘豚鼠ASMCs在10<,'-4>、2×10<'-4> mol·L<,'-1>ryanodine作用下，[Ca<'2+>]i迅速升高，與原代細(xì)胞比較，無明顯差異(P>0.05)。在濃度為5×10<'-5>mol·L<'-1>時(shí)，原代明顯高

15、于傳代(P<0.01)。 3、在正常豚鼠ASMCs中，RyR1和RyPa兩種RyR亞型mRNA表達(dá)，且以RyR2的表達(dá)為主，未見RyR3的表達(dá)。 4、在哮喘豚鼠ASMCs中，也只有RyR1和RyR2兩種亞型表達(dá)，同樣，以Ryk2的表達(dá)為主，但哮喘時(shí)，RyR1的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。 結(jié)論: 1、哮喘豚鼠ASMCsryanodine受體內(nèi)鈣釋放功能升高。 2、特定條件下，哮喘傳代細(xì)胞仍然保持