Nogo-B對氣道平滑肌細胞生物學(xué)功能的影響及其與哮喘的相關(guān)性研究.pdf

1、背景：氣道結(jié)構(gòu)重塑尤其是氣道平滑肌重塑是支氣管哮喘病程中的重要病理改變之一。已有研究顯示這一改變與氣道平滑肌細胞的增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)特性的異常有關(guān),但具體機制尚不十分明確。業(yè)已證實,網(wǎng)狀蛋白家族4(Reticular protein family,RTN4)成員中的Nogo-B參與了血管平滑肌細胞的凋亡、增殖、遷移等生物學(xué)過程。對于具有同樣胚胎起源的氣道平滑肌細胞(Airway smooth muscle cell, ASMC),

2、Nogo-B在該細胞中的表達情況及生物學(xué)作用目前尚未見報道。因此,探討Nogo-B在氣道平滑肌細胞中的的表達,進一步闡明其對氣道平滑肌細胞的生物學(xué)功能的影響并揭示其在哮喘氣道結(jié)構(gòu)重塑中所起的作用,具有重要的學(xué)術(shù)價值。 目的：明確Nogo-B在原代培養(yǎng)的人支氣管平滑肌細胞表達情況及其表達下調(diào)對平滑肌細胞增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)特性的影響。同時,觀察哮喘相關(guān)炎癥介質(zhì)作用對氣道平滑肌細胞Nogo-B表達的影響,以探討Nogo-B在哮喘

3、氣道結(jié)構(gòu)重塑中的可能作用。 方法：一、人支氣管平滑肌細胞中Nogo-B mRNA及蛋白的表達情況 選用體外培養(yǎng)的原代人支氣管平滑肌細胞,以Hela細胞作為陽性對照,先提取細胞總RNA及蛋白,然后通過RT-PCR及Western Blotting等方法觀察了支氣管平滑肌細胞中Nogo-B mRNA及蛋白表達情況。 二、下調(diào)Nogo-B表達對氣道平滑肌細胞增殖、凋亡和遷移的影響 (一)在采用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的

4、siRNA干擾的方法下調(diào)入支氣管平滑肌細胞Nogo-B的表達后,檢測各實驗組細胞總數(shù)(CCK-8法),并比較其差異,以評價Nogo-B表達下調(diào)對人支氣管平滑肌細胞增殖的影響。 (二)在采用siRNA干擾的方法有效下調(diào)了人支氣管平滑肌細胞Nogo-B的表達后,以TNF-α刺激各實驗組細胞一定時間以誘導(dǎo)凋亡,然后采用Annexin V/PI雙染法于流式細胞儀上計數(shù)各實驗組早期凋亡的細胞占總細胞數(shù)的比例,以評價Nogo-B表達下調(diào)對T

5、NF-α誘導(dǎo)的人支氣管平滑肌細胞凋亡的影響。 (三)將人支氣管平滑肌細胞接種于Millicell小室中,繼而采用siRNA干擾的方法下調(diào)細胞Nogo-B的表達。在RNA干擾起效后,通過調(diào)高Millicell小室外室的血清濃度以開始細胞遷移實驗。通過檢測各實驗組發(fā)生遷移的細胞總數(shù),以評價Nogo-B表達下調(diào)對人支氣管平滑肌細胞遷移的影響。 三、哮喘相關(guān)炎癥介質(zhì)對氣道平滑肌細胞Nogo-B表達的影響 在完成上述實驗的

6、基礎(chǔ)上,選擇哮喘相關(guān)的炎癥介質(zhì)IL-4、IL-13,分別以IL-4(10ng/ml)、IL-13(10ng/ml)及兩者的組合(各10ng/ml)刺激體外培養(yǎng)的原代人支氣管平滑肌細胞,采用Realtime PCR及Western Blotting等方法分別檢測不同時間點mRNA及蛋白表達的變化,以評價哮喘相關(guān)炎癥介質(zhì)對支氣管平滑肌細胞Nogo-B表達的影響。 結(jié)果：一、人支氣管平滑肌細胞中Nogo-B mRNA及蛋白的表達情況

7、 提取人支氣管平滑肌細胞及Hela細胞的總RNA及蛋白后,rt-PCR結(jié)果顯示在300bp處Hela細胞及人支氣管平滑肌細胞均可見Nogo-B mRNA特異性條帶表達。而Western Blotting顯示在約37kD處,人支氣管平滑肌細胞及Hela細胞均可見Nogo-B蛋白表達。從而證實人支氣管平滑肌細胞中存在Nogo-B的表達。 二、下調(diào)Nogo-B表達對人支氣管平滑肌細胞增殖、凋亡和遷移的影響 (一)采用si

8、RNA干擾下調(diào)人支氣管平滑肌細胞中Nogo-B表達后72小時,細胞計數(shù)結(jié)果顯示(CCK-8法),與陰性siRNA對照組比,Nogo-B表達下調(diào)組細胞數(shù)高于陰性對照組,但兩者無顯著性差異。(Nogo-B表達下調(diào)組1.244±0.188,陰性對照組1.1974±0.114,P＞0.05)。提示Nogo-B表達下調(diào)對人支氣管平滑肌細胞的增殖無明顯影響。 (二)在采用siRNA干擾下調(diào)入支氣管平滑肌細胞Nogo-B表達的基礎(chǔ)上,Anne

9、xin-V/PI雙染法結(jié)果顯示TNF-a處理前后Nogo-B表達下調(diào)組凋亡細胞增加數(shù)明顯低于陰性對照組,兩者有統(tǒng)計學(xué)差異(陰性對照組9.65±0.42％,Nogo-B表達下調(diào)組0.02±0.11％,P＜0.01)。提示Nogo-B表達下調(diào)可減少TNF-a誘導(dǎo)的支氣管平滑肌細胞凋亡。 (三)在采用siRNA干擾下調(diào)人支氣管平滑肌細胞Nogo-B表達的基礎(chǔ)上,分別對Nogo-B下調(diào)組、陰性siRNA對照組發(fā)生遷移的細胞總數(shù)進行計數(shù),

10、結(jié)果顯示,與陰性siRNA對照組相比,Nogo-B表達下調(diào)組減少了4.4倍,兩者有統(tǒng)計學(xué)差異(陰性對照組0.616±0.04,Nogo-B表達下調(diào)組0.164±0.006,P＜0.01)。提示Nogo-B表達下調(diào)可抑制人支氣管平滑肌細胞的遷移功能。 三、哮喘相關(guān)炎癥介質(zhì)對氣道平滑肌細胞Nogo-B表達的影響 (一)IL-4(10ng/ml)、IL-13(10ng/ml)單獨刺激24小時未能使人支氣管平滑肌細胞中Nogo-

11、B的表達水平發(fā)生顯著變化,而IL-4和IL-13(各 10ng/ml)共同作用后,Nogo-B mRNA表達出現(xiàn)降低,其中1h時表達量較Oh基礎(chǔ)值下降約7倍(相對CT值：0小時1,1小時0.136±0.009,P＜0.01),隨著時間推移其表達逐漸恢復(fù)。且IL-4、IL-13共同作用12小時后,人支氣管平滑肌細胞中Nogo-B蛋白表達開始下降,至24小時時下降最為明顯,各時間點的空白對照無明顯變化。提示Nogo-B可能作為哮喘氣道炎癥導(dǎo)