香煙對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞蛋白激酶C的影響及其在哮喘氣道重建發(fā)病機(jī)理中的意義.pdf

1、目的：眾所周知，吸煙有害健康。香煙燃燒時(shí)產(chǎn)生的煙霧中含有數(shù)千種化學(xué)物質(zhì)，其中數(shù)百種是有害有毒物質(zhì)，這些有害有毒物質(zhì)可引起多系統(tǒng)疾病，尤其是呼吸系統(tǒng)疾病，如慢性支氣管炎、肺氣腫、慢性肺心病、肺癌等。雖然目前尚無(wú)實(shí)驗(yàn)證實(shí)吸煙可直接引起支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)，但是已有研究證實(shí)香煙煙霧(cigarettesmoke，CS)可增加成人及兒童哮喘的發(fā)生頻率及癥狀的嚴(yán)重程度。吸煙雖可作為哮喘發(fā)作的誘因是哮喘的惡化因子，但其原因尚不明確。 支氣

2、管哮喘的重要特征是慢性氣道炎癥、持續(xù)性氣道高反應(yīng)性(airwayhyperresponsiveness，AHR)和氣道重建，三者相互作用，互為因果。氣道重建是氣道炎癥和持續(xù)性氣道高反應(yīng)性長(zhǎng)期存在的結(jié)果，可導(dǎo)致不可逆性的氣流阻塞。氣道平滑肌作為氣道壁的重要組成成分，其細(xì)胞增殖在哮喘氣道重建中起著重要作用，是不可逆性氣流阻塞、持續(xù)性氣道高反應(yīng)性的重要病理基礎(chǔ)。因此，探討氣道平滑肌細(xì)胞(airwaysmoothmusclecells，ASMC

3、s)增殖的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以明確哮喘發(fā)病機(jī)理、尋找更為有效的治療方法，成為目前國(guó)內(nèi)、外哮喘研究的熱點(diǎn)之一。 蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一種關(guān)鍵酶，是細(xì)胞外信號(hào)與細(xì)胞核反應(yīng)間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路，可參與多種細(xì)胞的增殖，在多種促有絲分裂因子誘導(dǎo)培養(yǎng)的非哮喘ASMCs的增殖中起重要作用；PKC有多種亞型，且每種亞型的結(jié)構(gòu)和功能各不相同。此外，我們既往的研究表明PKC在哮喘模型大鼠及哮喘患

4、者血清被動(dòng)致敏人氣道平滑肌細(xì)胞(HASMCs)增殖調(diào)控中亦起重要作用。但其詳細(xì)機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。 香煙煙霧能使卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)致敏的豚鼠氣道炎癥及持續(xù)性氣道高反應(yīng)性增加。國(guó)內(nèi)研究表明香煙煙霧提取物(cigarettesmokeextract，CSE)可使家兔的ASMCs增殖活性增加。研究資料表明CSE可使多種細(xì)胞PKC活化。因而推測(cè)CSE可能通過(guò)激活PKC而在ASMCs的增值、轉(zhuǎn)化、分泌等活動(dòng)中起作用。

5、 目前國(guó)內(nèi)、外通常是分別研究與哮喘有關(guān)的各種影響因子對(duì)非哮喘ASMCs增殖的影響，但由于非哮喘ASMCs和哮喘ASMCs的表型和功能狀態(tài)存在差異，這種在體外分別以單一因子誘導(dǎo)非哮喘ASMCs增殖來(lái)推斷哮喘ASMCs體內(nèi)的增殖特性及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的方法尚存在一定局限性。故以來(lái)自哮喘個(gè)體的ASMCs為研究對(duì)象可能更準(zhǔn)確地反映體內(nèi)ASMCs增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。同時(shí)，由于哮喘患者的氣道平滑肌細(xì)胞很難獲得，國(guó)外研究者用變應(yīng)性哮喘患者血清孵育人

6、ASMCs，為研究哮喘發(fā)病機(jī)理提供了一個(gè)很好的被動(dòng)致敏哮喘模型。 銀杏葉(Ginkgo)制劑具有改善血液流變學(xué)、清除自由基、拮抗血小板活化因子(PAF)等作用，臨床上主要用于治療老年癡呆、心腦血管疾病、支氣管哮喘和臟器移植的異體排斥等。 因此，本研究擬分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(第一部分)和人體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(第二部分)兩大部分，第一部分又分3個(gè)分題，第二部分又分2個(gè)分題，評(píng)價(jià)CSE對(duì)哮喘模型大鼠及被動(dòng)致敏人ASMCs的PKC活性、亞型PKC

7、-α、ζ表達(dá)及增殖特性的影響，評(píng)價(jià)香煙煙霧及銀杏葉(Ginkgo)注射液對(duì)哮喘氣道重建的影響，探討CSE是否通過(guò)PKC途徑參與了ASMCs的增殖和哮喘氣道重建及銀杏葉對(duì)哮喘氣道重建是否具有抑制作用，為進(jìn)一步明確哮喘發(fā)病機(jī)制、尋找更有針對(duì)性的治療方法提供一些理論依據(jù)。 方法：本研究通過(guò)建立大鼠哮喘模型和大鼠哮喘煙熏模型，培養(yǎng)哮喘大鼠ASMCs；通過(guò)哮喘患者血清被動(dòng)致敏人氣道平滑肌細(xì)胞(HASMCs)，并應(yīng)用CSE及PKC的激動(dòng)劑P

8、MA和特異性抑制劑Ro-31-8220等作為工具藥干預(yù)上述細(xì)胞，采用同位素γ-32P-ATP催化活性測(cè)定法檢測(cè)PKC的活性；用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期、MTT法及氚標(biāo)－胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TdR)摻入法檢測(cè)上述細(xì)胞增殖活性；用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞PKC-α及PKC-ζ的mRNA表達(dá)；用Westernblot檢測(cè)細(xì)胞PKC-α及PKC-ζ的蛋白表達(dá)。評(píng)估CSE對(duì)哮喘模型大鼠及被動(dòng)致敏人ASMCs的PKC活性、增殖特性及PKC亞型PK

9、C-α、ζ表達(dá)的影響，探討CSE是否通過(guò)PKC途徑參與了ASMCs的增殖及哮喘氣道重建，以更準(zhǔn)確地反映CSE影響哮喘ASMCs增殖的調(diào)控機(jī)制。 另外，大鼠哮喘氣道重建模型制備后，采用圖像分析系統(tǒng)觀察氣道壁厚度和面積及天狼星紅苦味酸染色觀察氣道壁膠原纖維沉積，采用RT-PCR和Westernblot法檢測(cè)氣道組織TGF-β1mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，探討CSE對(duì)哮喘大鼠氣道重建的影響。 結(jié)果：1.哮喘組大鼠ASMCs的P

10、KC活性、增殖及PKC亞型PKC-α、ζmRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組ASMCs(P＜0.01)。與對(duì)照組比較，5％CSE及50nmol/LPMA均能促進(jìn)哮喘組大鼠ASMCs的PKC活性、增殖及PKC亞型PKC-α、ζmRNA和蛋白表達(dá)的增加，其中以CSE+PMA組更為顯著(P＜0.01)。哮喘組大鼠ASMCs和對(duì)照組大鼠ASMCs經(jīng)5μmol/LRo-31-8220預(yù)處理后可消除5％CSE及50nmol/LPMA的作用；用5μmo

11、l/LRo-31-8220能抑制哮喘大鼠ASMCs的增殖及PKC亞型PKC-α、ζ的表達(dá)(P＜0.01)。2.哮喘煙熏組大鼠氣道ASMCs增殖、氣道壁厚度和面積及膠原面積顯著高于哮喘組(P＜0.01)；哮喘組大鼠氣道ASMCs增殖、氣道壁厚度和面積及膠原面積又顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。哮喘模型制備成功后，每天每次OVA激發(fā)后，再給予香煙煙霧吸入，連續(xù)8周，成功制備哮喘吸煙模型。3.哮喘血清被動(dòng)致敏的HASMCs的PKC活性、增殖及

12、PKC亞型PKC-α、ζmRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照血清處理的HASMCs(P＜0.01)。與對(duì)照組比較，5％CSE及50nmol/LPMA均能促進(jìn)被動(dòng)致敏的HASMCs的PKC活性、增殖及PKC亞型PKC-αmRNA和蛋白表達(dá)和PKC亞型PKC-ζ蛋白表達(dá)的增加，其中以CSE+PMA組更為顯著(P＜0.01)。5μmol/LRo-31-8220能顯著抑制被動(dòng)致敏的HASMCs增殖及PKC亞型PKC-αmRNA和蛋白的表達(dá)(P＜0.

13、05)。4.銀杏葉注射液可以明顯減弱哮喘煙熏組及哮喘組大鼠增加的氣道壁厚度和面積、膠原面積及氣道組織TGF-β1mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的程度。 結(jié)論：1.CSE使哮喘模型大鼠及被動(dòng)致敏人ASMCs的PKC活性、增殖及PKC亞型PKC-α、ζmRNA和蛋白表達(dá)增加。2.CSE使哮喘模型大鼠及被動(dòng)致敏人ASMCs的增殖及PKC亞型PKC-αmRNA和蛋白表達(dá)增加、PKC亞型PKCζ蛋白表達(dá)增加。3.CSE可能通過(guò)PKC途徑增加哮喘大鼠

14、和被動(dòng)致敏人的ASMCs增殖。4.首次成功建立大鼠哮喘煙熏氣道重建模型。5.CSE可能參與了哮喘模型大鼠的氣道重建過(guò)程；CSE使氣道組織TGF-β1mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)增加。6.銀杏葉可能通過(guò)部分減弱哮喘煙熏組及哮喘組大鼠增加的氣道壁厚度和面積、膠原面積及氣道組織TGF-β1mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的增加，從而對(duì)模型大鼠的氣道重建具有抑制作用。 綜上所述，本課題通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明CSE可能通過(guò)PKC途徑參與了哮喘大