地西他濱對小鼠淋巴瘤細胞免疫原性的增強作用及機制探索.pdf

1、地西他濱(Decitabine，DAC)作為一種新型去甲基化藥物，主要用于骨髓異常增生綜合征(Myelodysplastic Syndrome，MDS)及急性髓系白血病(AcuteMyeloid Leukemia，AML)的治療。研究發(fā)現(xiàn)DAC可以上調許多免疫相關的分子，增強腫瘤細胞的免疫原性，在白血病患者的治療中發(fā)現(xiàn)，去甲基化藥物可以誘導產生腫瘤特異性細胞毒性T細胞(Cytotoxic Lymphoctye，CTL)，人們推測去甲基化

2、藥物具有增強抗腫瘤免疫反應的作用。我們選取小鼠T淋巴瘤/淋巴細胞白血病細胞EL4，建立小鼠淋巴瘤模型，研究DAC對EL4細胞免疫原性的增強作用并對其機制進行探索。
　　 1.地西他濱誘導小鼠淋巴瘤細胞EL4凋亡
　　 我們用不同濃度的DAC體外處理EL4細胞，通過CCK-8法檢測細胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)DAC對EL4細胞的生長抑制作用具有濃度依賴性，0.25μM時，有30％的增殖抑制作用。此時，細胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，呈現(xiàn)出

3、一種不典型的凋亡狀態(tài)，且在體內成瘤性也明顯下降。經過Amaexin-V/PI雙染后，流式檢測發(fā)現(xiàn)DAC濃度越高，細胞凋亡越明顯，且以早期凋亡為主。
　　 2.地西他濱上調CD80分子
　　 基因表達譜芯片篩查結果顯示，DAC處理后EL4細胞腫瘤相關抗原和CD分子(Cluster of Differentiation)的表達都上調了，其中CD80表達的上調很明顯。我們利用PCR技術和流式細胞儀檢測，證實DAC上調EL4細胞

4、CD80在mRNA和蛋白水平的表達，上調狀態(tài)在體外能夠持續(xù)30天左右。同時我們發(fā)現(xiàn)DAC體內治療也能夠上調EL4細胞CD80的表達量。通過對EL4細胞CD80啟動子區(qū)甲基化測序，我們發(fā)現(xiàn)CD80的表達跟DNA甲基化關系密切。
　　 3.地西他濱上調CD80強化抗腫瘤免疫反應
　　 在動物實驗中，我們發(fā)現(xiàn)DAC能夠抑制EL4細胞的成瘤性。通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，DAC治療后腫瘤內T細胞侵潤明顯增多。胞內細胞因子染色結果表明

5、：T細胞IL-2和IFN-γ的分泌量也明顯增加。利用抗-CD8和抗-CD4單克隆抗體建立淋巴瘤小鼠CD8+T細胞或CD4+T體內清除模型，發(fā)現(xiàn)DAC治療后CD8+T參與了抗腫瘤反應。
　　 混合淋巴細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)DAC處理后的EL4細胞能夠有效刺激淋巴細胞增殖，刺激T細胞分泌IL-2和IFN-γ，當CD80被阻斷后，其對淋巴細胞的刺激能力下降。通過流式分選技術從DAC處理后的EL4細胞中分選出CD80+和CD80-細胞群，對小鼠進

6、行接種，發(fā)現(xiàn)CD80+組小鼠腫瘤生長明顯緩慢，且部分腫瘤會停止生長并縮小，流式分析結果發(fā)現(xiàn)CD80+組腫瘤中T細胞和NK細胞的侵潤都顯著高于CD80-組，說明DAC誘導CD80上調，增強腫瘤免疫原性，強化了抗腫瘤免疫反應。
　　 綜上，我們的研究發(fā)現(xiàn)DAC可以誘導EL4細胞表達多種免疫相關分子，增強其免疫原性，其中CD80起重要的作用，并首次發(fā)現(xiàn)CD80表達跟DNA甲基化的關系，豐富了免疫調節(jié)受表觀調控的內容，為去甲基化藥物增強