吉西他濱清除MDSC及促進(jìn)DC成熟對(duì)淋巴瘤的治療作用與機(jī)制研究.pdf

1、當(dāng)前各類淋巴瘤中以B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病率最高，其中濾泡淋巴瘤及小淋巴細(xì)胞淋巴瘤對(duì)DC免疫治療較為敏感，國(guó)外已經(jīng)開展了多項(xiàng)臨床試驗(yàn)，初步觀察到一定的療效，但沒有獲得最終的成功，離臨床廣泛應(yīng)用還有較大的差距，主要是目前使用的DC免疫治療策略仍難以克服淋巴瘤復(fù)發(fā)的問(wèn)題。
　　增強(qiáng)DC免疫治療療效的一個(gè)策略是清除腫瘤患者體內(nèi)異常增多的免疫抑制細(xì)胞。近年來(lái)大量研究顯示多種類型的腫瘤（包括淋巴瘤）患者體內(nèi)的髓系來(lái)源抑制細(xì)胞(myeloid-de

2、rived suppressor cell，MDSC)異常增多，大量累積的MDSC是腫瘤患者體內(nèi)主要的免疫抑制細(xì)胞，MDSC能夠通過(guò)分泌多種抑制因子，抑制T細(xì)胞及NK細(xì)胞的功能，在腫瘤的免疫逃逸中起著重要的作用。應(yīng)用化療藥物清除免疫抑制細(xì)胞可以成為DC疫苗治療的重要協(xié)同策略。一項(xiàng)研究顯示低劑量吉西他濱可以選擇性清除間皮瘤荷瘤小鼠體內(nèi)的MDSC，而不殺傷T細(xì)胞和B細(xì)胞。因此通過(guò)吉西他濱化療一方面可以殺傷腫瘤細(xì)胞降低腫瘤負(fù)荷，另一方面可以清

3、除體內(nèi)MDSC而有效解除免疫抑制。
　　增強(qiáng)DC免疫治療療效的另一個(gè)策略是改變目前DC疫苗的接種模式，以往大都采用腫瘤抗原體外沖擊的DC作為疫苗，通過(guò)皮下注射等方式進(jìn)行接種，這種方法并不符合體內(nèi)DC抗腫瘤的生理過(guò)程，存在諸多不足。改用未經(jīng)體外抗原沖擊的半成熟(semi-mature)DC瘤內(nèi)注射的方法進(jìn)行免疫接種，能夠更好地保持DC的活性和功能，在瘤體內(nèi)注射后可以更加直接、充分地接觸、攝取腫瘤細(xì)胞死亡后釋放的抗原及DAMP(dam

4、age associated molecular pattern)，分化為成熟的DC。這一方法更加符合體內(nèi)DC抗腫瘤的生理過(guò)程，并且在數(shù)量和質(zhì)量上能夠更加保證對(duì)抗腫瘤免疫功能的充分激發(fā)。
　　目前尚不明確MDSC是否能夠促進(jìn)小鼠B細(xì)胞淋巴瘤的生長(zhǎng)、淋巴瘤荷瘤小鼠體內(nèi)的MDSC是否增多、增多的MDSC對(duì)吉西他濱化療是否敏感，以及在吉西他濱化療后序貫進(jìn)行瘤內(nèi)注射半成熟DC治療淋巴瘤，二者是否能夠發(fā)揮抗腫瘤協(xié)同效應(yīng)。
　　目的:<

5、br>　　1建立小鼠MDSC體外培養(yǎng)新體系:模擬MDSC在體內(nèi)發(fā)育生成的微環(huán)境，擴(kuò)增出大量高純度的MDSC，研究其對(duì)小鼠B細(xì)胞淋巴瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的影響;
　　2進(jìn)一步檢測(cè)淋巴瘤荷瘤小鼠體內(nèi)MDSC的數(shù)量及吉西他濱對(duì)小鼠MDSC的體內(nèi)外清除作用，觀察經(jīng)過(guò)吉西他濱處理的淋巴瘤細(xì)胞對(duì)半成熟DC分化成熟的影響;
　　3最后應(yīng)用吉西他濱化療后序貫進(jìn)行瘤內(nèi)注射半成熟DC的方案治療小鼠B細(xì)胞淋巴瘤，檢測(cè)小鼠體內(nèi)抗腫瘤免疫功能并觀察二者是否能夠

6、發(fā)揮抗腫瘤協(xié)同效應(yīng)，并分析哪種免疫效應(yīng)細(xì)胞起主要的作用。
　　方法:
　　1.以絲裂霉素C滅活的脾臟內(nèi)皮型基質(zhì)細(xì)胞107B作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，加入小鼠骨髓細(xì)胞及高劑量mGM-CSF，以無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)獲MDSC;以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞免疫表型;抗Gr-1抗體標(biāo)記后免疫磁珠進(jìn)一步分選純化MDSC，應(yīng)用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基進(jìn)行集落形成細(xì)胞檢測(cè)，以及尾靜脈回輸全身照射(8Gy)的小鼠檢測(cè)脾集落形成單位(CFU-S);應(yīng)用熒光探針DCF

7、DA檢測(cè)ROS的產(chǎn)生，異去硝基苯丙酮測(cè)尿素法測(cè)定精氨酸酶;CCK8法檢測(cè)MDSC體外對(duì)Con-A刺激的T細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MDSC對(duì)OT-1小鼠來(lái)源的OVA多肽特異性CD8+T細(xì)胞（CFSE標(biāo)記）增殖的影響;流式檢測(cè)MDSC回輸Foxp3-IRES-GFP小鼠后外周血Treg細(xì)胞的比例變化;應(yīng)用急性GVHD模型觀察MDSC回輸后小鼠的排異癥狀以及小鼠的生存率;MDSC與A20淋巴瘤細(xì)胞共同皮下接種后監(jiān)測(cè)淋巴瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的情況。

8、
　　2.皮下接種2×105的A20細(xì)胞建立小鼠淋巴瘤模型，第30天小鼠皮下形成直徑＞2.0cm的淋巴瘤后，取小鼠脾臟，抗Gr-1-PC5、抗CD11b-PE抗體標(biāo)記后流式細(xì)胞儀檢測(cè)荷瘤小鼠脾臟內(nèi)MDSC的比例;免疫磁珠分選Gr-1+的荷瘤小鼠脾臟MDSC，流式檢測(cè)細(xì)胞免疫表型;分選獲得的MDSC加入吉西他濱（10μg/ml）培養(yǎng)24h、48h后，以AnnexinⅤ-FITC/PI染色后流式檢測(cè)凋亡;荷瘤30天的小鼠腹腔注射120

9、mg/kg吉西他濱，48h后流式檢測(cè)小鼠脾臟中MDSC的比例及淋巴瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例;小鼠骨髓細(xì)胞加入mGM-CSF培養(yǎng)獲半成熟DC，加入經(jīng)吉西他濱（10μg/ml）預(yù)處理4h的A20細(xì)胞，混勻共同培養(yǎng)48h后標(biāo)記抗CD11c-APC和抗CD86-PE抗體，流式分析DC的成熟分化情況;荷瘤30天的小鼠腹腔注射120mg/kg吉西他濱，48h后序貫進(jìn)行瘤內(nèi)注射5×106的CFSE標(biāo)記DC，48h后取小鼠外周血、脾臟及DC注射部位的腫瘤組

10、織制備細(xì)胞懸液，標(biāo)記抗CD11c-APC和抗CD86-PE抗體，流式分析DC的成熟分化情況。
　　3.取荷瘤30天的小鼠隨機(jī)分組，腹腔注射吉西他濱(120mg/kg)或生理鹽水，第32天瘤內(nèi)注射DC或生理鹽水，5組分別為:a.腹腔注射生理鹽水+瘤內(nèi)注射生理鹽水(NS組)、b.腹腔注射生理鹽水+瘤內(nèi)注射DC5×105/只（DC組）;c.腹腔注射吉西他濱+瘤內(nèi)注射生理鹽水（GEM組）;d.腹腔注射吉西他濱+瘤內(nèi)注射DC5×105/只（

11、GEM+DC組）;e.腹腔注射吉西他濱+瘤內(nèi)注射DC5×105/只+MDSC5×106/只（GEM+DC+MDSC組），觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況，每3天測(cè)量小鼠移植瘤的長(zhǎng)徑及短徑，觀察各組小鼠的生存時(shí)間;DC瘤內(nèi)注射后第7天，取各組3只小鼠脾臟制備細(xì)胞懸液，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IFN-γ的水平;小鼠脾臟細(xì)胞加絲裂霉素C滅活的A20細(xì)胞及50IU/mL的mIL-2體外培養(yǎng)5天后，LDH釋放法檢測(cè)對(duì)A20細(xì)胞的殺傷;取各組小鼠脾臟及腫瘤組織制

12、備單細(xì)胞懸液，分別加入抗CD4-PE、抗CD8-FITC及抗DX5-PE抗體標(biāo)記后流式檢測(cè)T細(xì)胞及NK細(xì)胞的比率;取各組小鼠腫瘤組織經(jīng)4％多聚甲醛溶液固定后切片，加入抗DX5-PE抗體及抗NKG2D-FITC抗體孵育后，DAPI液核染色后激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)瘤內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量;在淋巴瘤接種后的第24、26、28、30、32及35天給小鼠腹腔注射300mg的抗asialo-GM1抗體清除體內(nèi)NK細(xì)胞，或給小鼠腹腔注射100mg的抗CD

13、4抗體(GK1.5)及抗CD8抗體(TIB105)清除體內(nèi)T細(xì)胞，觀察體內(nèi)清除這些免疫細(xì)胞后對(duì)吉西他濱與DC聯(lián)合治療淋巴瘤療效的影響。
　　結(jié)果:
　　1.應(yīng)用小鼠脾臟內(nèi)皮型基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，模擬MDSC體內(nèi)發(fā)育的微環(huán)境，從單只小鼠的骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)9天可以獲得4×108細(xì)胞，其中CD11b+Gr-1+的MDSC的比例達(dá)90％，與荷瘤小鼠體內(nèi)MDSC的免疫表型相似。體外CFC檢測(cè)表明培養(yǎng)第7天生成大量CFU-GM、少量C

14、FU-G及部分散在的成熟的單核細(xì)胞，而不生成其它集落;1×103MDSC回輸輻照小鼠后可以生成平均12-15個(gè)晚期脾結(jié)節(jié)。生成的MDSC具有極強(qiáng)的免疫抑制活性，能夠抑制Con-A刺激的T細(xì)胞增殖以及OVA多肽刺激的抗原特異性CD8+T細(xì)胞增殖;MDSC回輸小鼠后外周血中Treg細(xì)胞的比例增高3倍左右，能夠抑制急性GVHD，減輕GVHD癥狀，小鼠的死亡率由100％降至40％;與A20淋巴瘤細(xì)胞共同接種后淋巴瘤在小鼠的體內(nèi)的生長(zhǎng)速度明顯加快

15、。
　　2.在接種A20淋巴瘤細(xì)胞30天后的小鼠脾臟中MDSC的比例顯著增高達(dá)30％左右，MDSC的絕對(duì)數(shù)量超過(guò)正常小鼠的10倍。體外MDSC經(jīng)10ug/ml吉西他濱處理48h后83.2％的細(xì)胞發(fā)生了凋亡，應(yīng)用吉西他濱化療后荷淋巴瘤小鼠脾臟中MDSC的比例降為69％;吉西他濱化療也導(dǎo)致體內(nèi)A20淋巴瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。經(jīng)吉西他濱預(yù)處理4h的A20細(xì)胞與DC共同培養(yǎng)48h后，DC表達(dá)CD86的比例由11.3％增加至49.6％;荷淋巴瘤小

16、鼠給予吉西他濱化療后瘤內(nèi)注射半成熟DC，48h后可以檢測(cè)到回輸?shù)腄C中有82.8％轉(zhuǎn)變?yōu)镃D86+表型，而未接受化療組僅為26.2％。
　　3.荷淋巴瘤小鼠接受吉西他濱注射后序貫進(jìn)行瘤內(nèi)注射半成熟DC的治療后，小鼠脾細(xì)胞分泌的IFN-γ較對(duì)照組增高近10倍，殺傷A20腫瘤細(xì)胞的CTL活性顯著增高，腫瘤逐漸縮小并最終消失，90％的小鼠獲得長(zhǎng)期生存，而對(duì)照組小鼠均最終死亡。接受聯(lián)合治療的淋巴瘤荷瘤小鼠，流式檢測(cè)脾臟內(nèi)及瘤內(nèi)CD4+及C

17、D8+T細(xì)胞的比例與其他組無(wú)顯著差異，而瘤內(nèi)NK細(xì)胞比例由2.2％增高至6.9％，應(yīng)用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)，瘤內(nèi)浸潤(rùn)的NK細(xì)胞較對(duì)照組顯著增加;單抗體內(nèi)清除實(shí)驗(yàn)表明，清除CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞后聯(lián)合治療組的抗腫瘤效應(yīng)均有所減弱，而清除NK細(xì)胞組的作用最為明顯，腫瘤的生長(zhǎng)速度與對(duì)照組接近。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立了體外大規(guī)模擴(kuò)增高純度小鼠MDSC的培養(yǎng)體系，體外培養(yǎng)生成的MDSC具有強(qiáng)烈的免疫抑制活性

18、，與A20淋巴瘤細(xì)胞共同接種小鼠能夠顯著促進(jìn)淋巴瘤的生長(zhǎng)。
　　2.接種A20淋巴瘤細(xì)胞的小鼠在后期體內(nèi)也出現(xiàn)MDSC累積增多的現(xiàn)象，吉西他濱可以誘導(dǎo)MDSC發(fā)生凋亡，快速去除荷淋巴瘤小鼠體內(nèi)的MDSC，也可以誘導(dǎo)A20淋巴瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，并促進(jìn)瘤內(nèi)DC的分化成熟。
　　3.吉西他濱化療后序貫進(jìn)行瘤內(nèi)注射治療半成熟DC可以產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，可以激活體內(nèi)免疫細(xì)胞，有效清除巨大淋巴瘤并阻止復(fù)發(fā)，顯著提高小鼠存活率。CD8+T細(xì)