Ⅰ群禽腺病毒血清4型的分離鑒定及其對(duì)雞肝臟AvBDs、IL-1β和IL-6基因表達(dá)的影響.pdf

1、心包積液-肝炎綜合征(HHS)主要是由Ⅰ群禽腺病毒血清4型（FAdV-4）引起的家禽尤其是肉雞的一種高度傳染性疾病。該病在世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有發(fā)生和報(bào)道。我國(guó)河南省于2015年夏秋開(kāi)始暴發(fā)，隨后波及全省，給我省乃至全國(guó)的家禽生產(chǎn)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前，還沒(méi)有安全有效的疫苗用于該病的防控，因而研究該病病原的生物學(xué)特性和感染后機(jī)體先天免疫機(jī)制對(duì)于該病的防控具有現(xiàn)實(shí)意義。禽β-防御素(AvBDs)是機(jī)體內(nèi)一類(lèi)富含半胱氨酸的陽(yáng)離子抗菌肽，具有

2、廣譜抗微生物活性，其主要作用于微生物膜或宿主免疫細(xì)胞，引起極低的微生物耐藥性，作為一種新型的抗菌藥和疫苗佐劑被廣泛研究，其作為先天性防御機(jī)制的一部分對(duì)于家禽機(jī)體的抗感染免疫具有重要作用。鑒于此，本研究開(kāi)展了Ⅰ群禽腺病毒的分離鑒定及其對(duì)雞肝臟內(nèi)的β-防御素、IL-1β和IL-6基因表達(dá)規(guī)律研究，具體研究如下:
　　2015年9月，河南某雞場(chǎng)發(fā)生了以心包積水為特征的疫情，具有較高的死亡率。臨床解剖分析疑似心包積液-肝炎綜合征，病原可能

3、為禽腺病毒。采集發(fā)病雞的肝臟、心臟等病料接種11日齡SPF雞胚分離病毒，同時(shí)采用Ⅰ群禽腺病毒特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)及基因序列分析。結(jié)果表明，在病料與尿囊液中均擴(kuò)增出大小約900bp的目的片段;核酸同源性分析顯示該分離株與Ⅰ群禽腺病毒血清4型的相似性在97.7％-100％。系統(tǒng)發(fā)育分析表明該分離株與Ⅰ群禽腺病毒血清4型的遺傳距離最近。經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶StyⅠ和MluⅠ酶切鑒定分析，進(jìn)一步表明該分離株為血清4型。以上分析結(jié)果證明該分離株屬于Ⅰ

4、群禽腺病毒血清4型，將該分離株命名為HNXZ。
　　為了進(jìn)一步了解該分離株的生物學(xué)特性，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)特性觀察、動(dòng)物回歸試驗(yàn)、病理組織學(xué)檢查對(duì)獲得的分離株進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，該分離株在雞胚肝細(xì)胞(CEL)上可產(chǎn)生典型的禽腺病毒病變，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，腫脹、成簇、細(xì)胞皺縮，折光性增強(qiáng)等。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果顯示，攻毒雞的臨床癥狀和病理變化與自然發(fā)病雞基本一致。病理組織學(xué)變化以肝細(xì)胞核內(nèi)有噬堿性包涵體和肝細(xì)胞大片壞死為主，心肌細(xì)胞間有大量淋

5、巴細(xì)胞浸潤(rùn)。本試驗(yàn)為禽腺病毒的流行和防控提供一定的參考依據(jù)。
　　采用RT-PCR檢測(cè)了14種AvBDs在各個(gè)組織中的表達(dá)分布情況，結(jié)果表明AvBD1、2和10分布較廣泛，并首次發(fā)現(xiàn)AvBD14在腦組織中表達(dá)。同時(shí)建立AvBDs、IL-1β和IL-6SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量方法(qPCR)，該方法具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速等優(yōu)點(diǎn)，為進(jìn)一步實(shí)時(shí)定量檢測(cè)AvBDs、IL-1β和IL-6基因表達(dá)量奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
　　用已建立

6、的qPCR方法，檢測(cè)了HNXZ株對(duì)雞肝臟中AvBDs、IL-1β和IL-6基因表達(dá)的影響，并研究了其與體內(nèi)IL-1β和IL-6基因表達(dá)的相互關(guān)系。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，經(jīng)HNXZ株感染雞后AvBD4、8、10、13和IL-1β基因表達(dá)量顯著上調(diào)(p＜005);AvBD5和AvBD11的基因表達(dá)量顯著下調(diào)(P＜0.05);而AvBD2、AvBD3、AvBD6、IL-6基因表達(dá)量沒(méi)有明顯變化(P＞0.05)。雞感染HNXZ株4d后，AvB