亮氨酸通過(guò)蛋白酶體調(diào)控犢牛胰腺腺泡細(xì)胞淀粉酶的分泌.pdf

1、胰腺作為重要的消化器官，其分泌的淀粉酶在動(dòng)物消化利用小腸淀粉的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。奶牛十二指腸中的淀粉僅有42％-60％可被消化吸收，胰腺淀粉酶分泌的不足是限制奶牛等反芻動(dòng)物小腸淀粉利用的主要因素。本研究利用改進(jìn)的胰蛋白酶冷消化法分離荷斯坦?fàn)倥Ｒ认傧倥菁?xì)胞，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，研究亮氨酸對(duì)犢牛胰腺腺泡細(xì)胞淀粉酶分泌的影響及相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，以期為通過(guò)營(yíng)養(yǎng)手段改善奶牛等反芻動(dòng)物小腸淀粉消化提供理論參考。主要結(jié)果如下:

2、　　犢牛胰腺腺泡細(xì)胞的分離技術(shù)研究使用改進(jìn)后的胰蛋白酶冷消化法分離奶犢牛胰腺腺泡細(xì)胞，對(duì)分離得到的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并設(shè)置3、6、9小時(shí)的孵育時(shí)間梯度處理，對(duì)獲得的細(xì)胞數(shù)目及活率進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果表明:犢牛胰腺腺泡細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和小鼠及大鼠的胰腺腺泡細(xì)胞相似，均為懸浮細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量的酶原顆粒。孵育6小時(shí)和9小時(shí)時(shí)獲得的細(xì)胞數(shù)目較3小時(shí)明顯升高(P＜0.05)，活率并無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　亮氨酸對(duì)犢牛胰腺腺泡細(xì)胞淀粉

3、酶分泌的影響體外培養(yǎng)新鮮分離的犢牛胰腺腺泡細(xì)胞，培養(yǎng)液使用無(wú)亮氨酸的DMEM/F12，分別添加其正常亮氨酸濃度的0、0.5、1、3、9、27倍梯度處理（即0、0.225、0.45、1.35、4.05和12.15mmol/L）并于正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3小時(shí)。結(jié)果顯示:(1)隨著培養(yǎng)液中亮氨酸濃度由0倍提高至0.5、1、3倍時(shí)，上清培養(yǎng)液中的酶活出現(xiàn)了顯著下降(P＜0.05），當(dāng)亮氨酸添加濃度繼續(xù)升高時(shí)，酶活并未繼續(xù)降低(P＞0.05）;(2

4、)相較于0倍對(duì)照組，其他幾個(gè)亮氨酸濃度處理組的AF及CCK1R的蛋白表達(dá)均出現(xiàn)了顯著下降(P＜0.05）;(3)相較于對(duì)照組，其他幾個(gè)亮氨酸濃度處理組的蛋白酶體活性出現(xiàn)了顯著下降（P＜0.05），分別為對(duì)照組的76％、63％、24％、7％和9％。
　　蛋白酶體對(duì)犢牛胰腺腺泡細(xì)胞淀粉酶分泌調(diào)控在試驗(yàn)二結(jié)果的基礎(chǔ)上，以犢牛胰腺腺泡細(xì)胞為研究對(duì)象，設(shè)置無(wú)亮氨酸、正常濃度亮氨酸和高濃度亮氨酸（即0、1、27倍濃度，對(duì)應(yīng)0、0.45、12.

5、15mmol/L）的單獨(dú)添加及相應(yīng)濃度的亮氨酸與5μmol/L蛋白酶體抑制劑MG-132的混合添加處理，于正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3小時(shí)。結(jié)果顯示:(1)0倍和1倍添加組中亮氨酸和MG-132的混合添加相較于亮氨酸的單獨(dú)添加，培養(yǎng)液上清中的α-淀粉酶量出現(xiàn)了顯著下降（P＜0.05），27倍添加組中，亮氨酸和MG-132的混合添加并未降低α-淀粉酶的分泌(P＞0.05);(2)0倍和1倍組中，MG-132的添加均降低了CCK1R的蛋白表達(dá)水平(

6、P＜0.05），27倍組中，MG-132的添加有降低CCK1R表達(dá)的趨勢(shì)(P＜0.1）;(3)0倍和1倍亮氨酸添加組中，亮氨酸和MG-132的混合添加均顯著降低了蛋白酶體的活性(P＜0.05），分別為單獨(dú)添加相應(yīng)濃度亮氨酸時(shí)蛋白酶體活性的63％和72％。27倍亮氨酸添加組中亮氨酸與MG-132的混合添加相較于亮氨酸的單獨(dú)添加，蛋白酶體的活性并未出現(xiàn)顯著變化(P＞0.05）。
　　結(jié)論:改進(jìn)的胰蛋白酶冷消化法適用用于分離制備體犢牛胰