人工冬蟲(chóng)夏草在特發(fā)性肺纖維化的體外干預(yù)作用和機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一組慢性、進(jìn)行性、致纖維化性間質(zhì)性肺疾病，是多種肺部疾病的最終轉(zhuǎn)歸。特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是PF中最常見(jiàn)的類型，其病因未明，好發(fā)于老年人。IPF以進(jìn)行性呼吸困難及肺功能惡化為主要臨床表現(xiàn)，其組織病理學(xué)及胸部影像學(xué)特征性表現(xiàn)為尋常型肺間質(zhì)性肺炎（Usual interstitial pneumo

2、nia，UIP）。IPF預(yù)后不良，診斷后平均中位生存期僅為2.8-3.5年，5年死亡率高達(dá)80％，患者往往死于肺部本身疾病的進(jìn)展。既往ATS/ERS對(duì)IPF推薦的治療方案是以糖皮質(zhì)激素聯(lián)合硫唑嘌呤和/或環(huán)磷酰胺為基礎(chǔ)的抗炎治療，但臨床上僅有10%的患者受益，且長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和/或免疫抑制劑治療并不能改善IPF患者的生存率、疾病進(jìn)程和預(yù)后。遺憾的是，除了肺移植外，迄今為止尚未有確切有效的藥物用于治療IPF。因此研究和開(kāi)發(fā)治療IPF的藥

3、物研究具有非常重要的意義。
　　冬蟲(chóng)夏草是我國(guó)傳統(tǒng)藥用真菌，具有益精髓、補(bǔ)虛損、保肺益腎等功效?，F(xiàn)代研究表明具有抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等多種藥理作用，對(duì)腎臟、肝臟、肺臟、心臟和腦血管等重要臟器有保護(hù)作用。冬蟲(chóng)夏草的臨床應(yīng)用廣泛，但由于產(chǎn)量有限，無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的臨床需要和保健需要。人工冬蟲(chóng)夏草（百令膠囊）是以中華束絲孢為生產(chǎn)菌種人工培育、分離、發(fā)酵精制而成，與天然冬蟲(chóng)夏草具有相似的有效化學(xué)成分

4、，包括多糖類、核苷酸類、甘露醇、麥角甾醇類、氨基酸等。研究表明，人工冬蟲(chóng)夏草在慢性支氣管炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺結(jié)核等多種肺部疾病有良好的治療作用，對(duì)肝纖維化、腎纖維化、腹膜纖維化等器官纖維化有一定的防治作用。人工冬蟲(chóng)夏草在實(shí)驗(yàn)性肺纖維化動(dòng)物模型的干預(yù)作用也有初步的探討，其作用機(jī)制可能與抑制TGF-β1在肺組織中的表達(dá)，調(diào)整I型/II型細(xì)胞因子平衡有關(guān)；我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)人工冬蟲(chóng)夏草對(duì)博萊霉素所致大鼠肺纖維化有明顯的抗纖維化作

5、用，一方面，人工冬蟲(chóng)夏草對(duì)博萊霉素所致肺損傷早期有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)減少肺纖維化早期BALF細(xì)胞總數(shù)，降低中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分比，降低肺組織肺泡炎，降低BLAF中的LDH、TNF-α含量，下調(diào)MDA、iNOS水平，提高GSH含量而達(dá)到早期抗炎、抗氧化作用；另一方面應(yīng)用人工冬蟲(chóng)夏草與糖皮質(zhì)激素聯(lián)用具有協(xié)同治療作用，可能通過(guò)抑制PDGF，bFGF，TNF-α等細(xì)胞因子而達(dá)到減弱纖維化作用，且可減少糖皮質(zhì)激素的用量。但是，人

6、工冬蟲(chóng)夏草對(duì)人類IPF的治療作用和作用機(jī)制如何，目前尚未明確，因此我們?cè)O(shè)想，通過(guò)進(jìn)一步研究人工冬蟲(chóng)夏草對(duì)原代分離正常人和IPF患者成纖維細(xì)胞及II型肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549的干預(yù)作用，從而探討其對(duì)IPF治療作用及可能機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)分為兩部分，第一部分主要探討人工冬蟲(chóng)夏草對(duì)肺成纖維細(xì)胞的干預(yù)作用及可能作用機(jī)制；第二部分主要探討人工冬蟲(chóng)夏草對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)下肺肌成纖維細(xì)胞活化的抑制作用及可能作用機(jī)制。
　　第一部分：人工冬蟲(chóng)夏草對(duì)正常人

7、和IPF患者肺成纖維細(xì)胞的干預(yù)作用
　　目的：
　　探討人工冬蟲(chóng)夏草對(duì)正常人和IPF患者肺成纖維細(xì)胞干預(yù)作用及作用機(jī)制。
　　方法：
　　原代分離、培養(yǎng)、鑒定正常人肺成纖維細(xì)胞（pulmonary fibroblast from health human，N-LFB）和特發(fā)性肺纖維化患者肺成纖維細(xì)胞（pulmonary fibroblast from idiopathic pulmonary fibrosis p

8、atient，IPF-LFB）及II型肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549。不同濃度（2.5mg/ml、5mg/ml、7.5 mg/ml、10 mg/ml和12.5 mg/ml）人工冬蟲(chóng)夏草分別干預(yù)N-LFB、IPF-LFB和A54924h、48h和72h，MTT比色法檢測(cè)不同濃度人工冬蟲(chóng)夏草對(duì)N-LFB、IPF-LFB和A549生長(zhǎng)增殖影響；不同濃度人工冬蟲(chóng)夏草（2.5mg/ml、5mg/ml、7.5 mg/ml和10 mg/ml）分別干預(yù)N-LF

9、B、IPF-LFB48h，應(yīng)用realtime-PCR檢測(cè)人工冬蟲(chóng)夏草對(duì)N-LFB、IPF-LFB中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）和I型前膠原（collagen type I alpha1，COL1A1）mRNA表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.人工冬蟲(chóng)夏草能夠直接抑制正常人肺成纖維細(xì)胞、IPF患者肺成纖維細(xì)胞和II型上皮細(xì)胞系A(chǔ)549的生長(zhǎng)增殖。
　　2.在一定干預(yù)濃度下（2.5~12.5mg/ml）下，人工冬蟲(chóng)夏草對(duì)

10、N-LFB、IPF-LFB和A549生長(zhǎng)增殖抑制作用具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性，隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加，人工冬蟲(chóng)夏草對(duì)成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的抑制率呈上升趨勢(shì)，差異有極顯著性（p<0.01）。
　　3.人工冬蟲(chóng)夏草對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖抑制作用具有一定的細(xì)胞特異性，干預(yù)條件相同情況下，與N-LFB相比，對(duì)IPF-LFB具有更好的抑制作用。
　　4.人工冬蟲(chóng)夏草可通過(guò)下調(diào)CTGF和COL1A1 mRNA表達(dá)，抑制細(xì)胞外基

11、質(zhì)的合成。
　　結(jié)論：
　　1.人工冬蟲(chóng)夏草能夠直接抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖，具有時(shí)效-量效關(guān)系；
　　2.人工冬蟲(chóng)夏草對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖抑制作用具有一定的細(xì)胞特異性，對(duì)病變部位來(lái)源的成纖維細(xì)胞有更好的抑制效應(yīng)；
　　3.人工冬蟲(chóng)夏草可通過(guò)下調(diào)CTGF和COL1A1 mRNA表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成，具有濃度依賴性；
　　第二部分：人工冬蟲(chóng)夏草對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)下IPF患者肺成纖維細(xì)胞向肺肌成纖維細(xì)胞活化的

12、抑制作用及可能機(jī)制
　　目的：
　　研究人工冬蟲(chóng)夏草對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)下IPF患者肺成纖維細(xì)胞向肺肌成纖維細(xì)胞活化的抑制作用及可能作用機(jī)制。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)A549和IPF-LFB，以5ng/ul TGF-β1誘導(dǎo)A549和IPF-LFB向肺肌成纖維細(xì)胞（pulmonary myofibroblast，MF）轉(zhuǎn)分化。不同濃度人工冬蟲(chóng)夏草（2.5mg/ml、5mg/ml、7.5 mg/ml、10 mg/m

13、l和12.5 mg/ml）分別干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)下A549和IPF-LFB生長(zhǎng)增殖24h、48h和72h。MTT比色法檢測(cè)不同濃度人工冬蟲(chóng)夏草對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)下 A549和IPF-LFB增殖活化的抑制作用。取10 mg/ml人工冬蟲(chóng)夏草為最適干預(yù)濃度，Western-blotting檢測(cè)人工冬蟲(chóng)夏草對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)下A549和IPF-LFB向MF轉(zhuǎn)化過(guò)程中和已轉(zhuǎn)化MF后Smad3蛋白表達(dá)影響；Real-time PCR檢測(cè)人工冬蟲(chóng)

14、夏草對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)下A549和IPF-LFB向MF轉(zhuǎn)化過(guò)程中和已轉(zhuǎn)化MF后血管生長(zhǎng)因子（VEGF）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、I型前膠原（collagen type I alpha1，COL1A1）mRNA表達(dá)影響。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度人工冬蟲(chóng)夏草可抑制TGF-β1誘導(dǎo)下A549和IPF-LFB的增殖活化。隨藥物濃度和干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)A549和IPF-LFB的抑制呈上升趨勢(shì)

15、，具有時(shí)間和劑量依賴性。
　　2.10 mg/ml人工冬蟲(chóng)夏草可抑制TGF-β1誘導(dǎo)下A549向MF轉(zhuǎn)分化過(guò)程中Smad3蛋白的核轉(zhuǎn)位，部分逆轉(zhuǎn)IPF-LFB已分化MF Smad3蛋白表達(dá)。
　　3.人工冬蟲(chóng)夏草可下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)下和A549和IPF-LFB向MF轉(zhuǎn)分化和已分化MF中VEGF、CTGF、MMP-2、COL1A1 mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)論：
　　1.人工冬蟲(chóng)夏草可抑制TGF-β1誘導(dǎo)下A54