L-型電壓門(mén)控鈣通道α-,1C-亞基羧基末端肽段真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、目的: L-型電壓門(mén)控鈣通道(L-type voltage-gated calcium channels，L-VGCCs)是介導(dǎo)鈣內(nèi)流的主要途徑之一，在缺血性腦損傷的病理機(jī)制中扮演了一定的角色。神經(jīng)型L-VGCCs的主要功能亞基是α1c。本室前期研究結(jié)果表明，腦缺血/再灌注促進(jìn)了α1c與突觸后密集區(qū)關(guān)鍵性腳手架蛋白PSD-95(Postsynaptie density-95)的相互作用。本研究旨在構(gòu)建EGFP(Enhanced gree

2、n fluorescent protein，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)標(biāo)記的α1c亞基羧基術(shù)端肽段(CT；1587-2169)的真核表達(dá)載體，并在COS-7細(xì)胞中表達(dá)，從而為研究α1c與PSD-95的相互作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法: 本研究主要采用RT-PCR方法擴(kuò)增CT的cDNA并克隆至克隆載體pGEM-T和真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)；同時(shí)采用PCR方法擴(kuò)增了標(biāo)簽蛋白EGFP(Enhanced green fluorescen

3、t protein)的cDNA并克隆至克隆載體pGEM-T：然后亞克隆EGFP cDNA至pcDNA3.1(+)-CT，EGFP位于CT的羧基末端。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA3.1(+)-CT-EGFP重組體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡和免疫印跡等方法檢測(cè)重組體的表達(dá)。 結(jié)果: 擴(kuò)增了CT和EGFP的cDNA；構(gòu)建的pcDNA3.1-CT-EGFP真核表達(dá)載體經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定及測(cè)序分析證實(shí)了其序列的正確性；熒光顯微