MP65和Sap2重組表達(dá)質(zhì)粒對(duì)小鼠系統(tǒng)性白色念珠菌感染的免疫保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：白色念珠菌（Candida albicans，CA）是最常見(jiàn)的條件致病菌之一，近二三十年來(lái)已成為醫(yī)院內(nèi)感染（如手術(shù)創(chuàng)傷，器官移植和腫瘤治療等免疫抑制劑、廣譜抗生素應(yīng)用）和免疫力低下患者（原發(fā)和繼發(fā)免疫缺陷病，如AIDS）最重要的感染病原之一，系統(tǒng)性感染死亡率為40％～50％。盡管目前有新的抗真菌藥物在應(yīng)用，但是由于它們抗真菌譜窄，出現(xiàn)新的耐藥性，并沒(méi)有降低白色念珠菌感染的發(fā)生率和死亡率。因此研究安全有效的免疫制劑會(huì)為真菌感染的預(yù)防

2、和治療提供新的途徑，其中真菌疫苗的研究引人矚目。
　　 甘露聚糖-甘露糖蛋白交聯(lián)物是白色念珠菌細(xì)胞壁的重要組成成分，也是重要的粘附素分子，甘露糖蛋白65（65-kD mannoprotein，MP65）是從其酸性提取物中純化出來(lái)的主要甘露糖蛋白成分，分子量約65kD，具有很好的免疫原性，其中蛋白核心部分能誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答，對(duì)多種念珠菌感染有保護(hù)作用。分泌性酸性蛋白酶2（secretory acid proteinase，Sap2）

3、是白色念珠菌分泌產(chǎn)生的一種最重要的胞外蛋白酶，與白色念珠菌營(yíng)養(yǎng)作用、粘附、侵襲和破壞組織屏障密切相關(guān)，是白色念珠菌致病的重要毒力因子。Sap2是大多數(shù)白色念珠菌廣泛存在的一種抗原，以可溶性抗原形式存在于血清中，念珠菌病人的血清中存在高滴度的抗Sap2的抗體。研究表明以Sap2的白色念珠菌提取物免疫小鼠，可以減弱該菌對(duì)粘膜的感染。
　　 因此本研究選取編碼MP65、Sap2蛋白的基因，構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒及原核表達(dá)質(zhì)粒，以真核質(zhì)粒免

4、疫小鼠，分析MP65、Sap2的免疫原性以及其DNA疫苗在抵抗白色念珠菌系統(tǒng)性感染中的免疫保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究該蛋白功能及研制其真菌疫苗提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：1.原核、真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：熱酚法提取白色念珠菌總RNA，經(jīng)RT-PCR方法擴(kuò)增獲得mp65、sap2目的基因，克隆至pMD18-T載體上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確后，經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ和EcoRⅠ、XhoⅠ酶切再次鑒定，最后將其分別克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX4

5、T-2、pET32a和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1中。
　　 2.目的蛋白的表達(dá)、純化與鑒定：將重組原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶（IPTG）誘導(dǎo)、超聲裂解菌體、SDS-PAGE電泳觀察結(jié)果，獲得重組表達(dá)的包涵體蛋白。低濃度尿素梯度透析與金屬鎳螯合層析柱純化回收重組蛋白后，對(duì)重組蛋白進(jìn)行定量測(cè)定。Western blot、ELISA方法初步鑒定其抗原特異性及反應(yīng)性。
　　 3

6、.真核表達(dá)質(zhì)粒的大量提?。簤A裂解法分別大量提取真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-mp65和pcDNA3.1-sap2，純化后定量備用。
　　 4.動(dòng)物免疫：取40只4周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，雌雄各半，分別命名為pcDNA3.1-mp65質(zhì)粒組、pcDNA3.1-sap2質(zhì)粒組、pcDNA3.1-mp65+pcDNA3.1-sap2聯(lián)合質(zhì)粒組及PBS對(duì)照組，股四頭肌接種真核表達(dá)質(zhì)粒，每只100μg/次，每次間隔2

7、周，加強(qiáng)免疫3次，每次免疫前內(nèi)眥取血收集血清。
　　 5.免疫效果檢測(cè)：間接ELISA法檢測(cè)各免疫組血清特異性抗-MP65、抗-Sap2 IgG；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟內(nèi)CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞變化情況。
　　 6.攻毒實(shí)驗(yàn)：末次免疫后20天尾靜脈注射給予小鼠致死量白色念珠菌1×106個(gè)/只，15天內(nèi)觀察存活率。
　　 結(jié)果：1.經(jīng)RT-PCR方法克隆出全長(zhǎng)為1140bp的mp65和1197bp的sap2基因，

8、其核苷酸序列與GenBank中公布的序列基本同源。
　　 2.成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-2-mp65、pET32a-sap2及真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-mp65、pcDNA3.1-sap2。構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-2-mp65和pET32a-sap2轉(zhuǎn)化BL-21，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot證實(shí)，分別誘導(dǎo)表達(dá)出66KD左右的GST融合蛋白和His融合蛋白。表達(dá)的蛋白主要以包涵體形式存在。<

9、br>　　 3.真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-mp65和pcDNA3.1-sap2免疫動(dòng)物后，各免疫組小鼠血清IgG水平隨免疫時(shí)間延長(zhǎng)，抗體滴度逐漸升高。末次免疫后，抗-MP65 IgG最高效價(jià)可達(dá)到1：1600，抗-Sap2 IgG最高效價(jià)可達(dá)到1：3200。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果經(jīng)方差分析顯示，兩組質(zhì)粒免疫后均能誘導(dǎo)小鼠脾臟內(nèi)CD4+T細(xì)胞百分含量增加，與PBS對(duì)照組比較有顯著性差異（P<0.05）。而CD8+T細(xì)胞百分含量無(wú)明顯差異

10、。兩種質(zhì)粒單獨(dú)免疫組與聯(lián)合免疫組比較也無(wú)顯著性差異。
　　 4.白色念珠菌攻毒15天后，pcDNA3.1-mp65質(zhì)粒組及pcDNA3.1-sap2質(zhì)粒組各有20％的存活率，pcDNA3.1-mp65+pcDNA3.1-sap2聯(lián)合質(zhì)粒組存活率達(dá)到40％，PBS對(duì)照組存活率為0％，經(jīng)X2檢驗(yàn)有顯著差異（P<0.05）。
　　 結(jié)論：1.成功構(gòu)建了白色念珠菌基因mp65和sap2的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-2-mp65、p