不同缺血時(shí)間窗后適應(yīng)對(duì)心肌再灌注損傷的影響及再灌注損傷搶救激酶介導(dǎo)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：本研究旨在觀察不同缺血時(shí)間窗缺血后適應(yīng)(IPC)對(duì)心肌缺血再灌注(I/R)損傷的影響以及IPC心肌保護(hù)作用的相關(guān)影響因素，并進(jìn)一步探討再灌注損傷搶救激酶(RISK)在IPC減少心肌再灌注損傷中的作用機(jī)制。本研究包括：1)建立小鼠在體IPC模型，觀察不同缺血時(shí)間窗IPC對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響，探討IPC心肌保護(hù)作用最佳時(shí)機(jī)以及與缺血預(yù)適應(yīng)(IP)的關(guān)系。2)建立小鼠離體心臟Langendorff缺血再灌注模型，探討IPC對(duì)離體小

2、鼠心肌再灌注損傷的作用以及與凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的關(guān)系。3)探討再灌注損傷搶救激酶ERK1/2作為Bcl-2與Bax的上游靶酶在IPC減少心肌缺血再灌注細(xì)胞凋亡中的作用。 方法： 課題第一部分：1)選擇成年120只C57BL小鼠，建立在體小鼠心肌缺血再灌注模型，隨機(jī)分為缺血時(shí)間30min、45min和60min，每一缺血時(shí)間又分為IPC和I/R注兩種處理，之后再灌注3h。通過(guò)開(kāi)胸結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈造成急性心肌梗死，

3、在完全再灌注早期給予反復(fù)短暫再通/閉塞的IPC。采用伊文氏蘭(Evans blue)和三苯基氯化四氮唑(TTC)染色的方法確定缺血心肌和梗死心肌面積，并測(cè)定血清的肌酸激酶(CK)的含量、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、心肌超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)含量。2)選擇成年120只C57BL小鼠，建立在體小鼠心肌缺血再灌注模型，隨機(jī)分成如下6組，均接受心肌缺血30min(假手術(shù)組除外)。①I/R組；②3次IPC組：再灌注前進(jìn)行缺血10s，

4、再灌注10s，此為一個(gè)循環(huán)，共計(jì)3個(gè)后適應(yīng)循環(huán)；③6次IPC組：再灌注前進(jìn)行6個(gè)后適應(yīng)循環(huán)；④延遲IPC組：恢復(fù)再灌注1min后進(jìn)行3次后適應(yīng)循環(huán)；⑤IPC+IP組：在心梗模型建立前，短暫缺血5min后恢復(fù)血流10min，再完成30min的缺血，之后處理同3次IPC組，隨后再灌注3h；⑥假手術(shù)組。分別測(cè)定梗死心肌面積、血清CK、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、心肌MDA水平以及SOD活性。 課題第二部分：1)建立并改良小鼠離體心臟Langend

5、orff灌流模型，72只成年C57BL小鼠均進(jìn)行穩(wěn)定灌流30min，隨機(jī)分為3組：①IPC組：停止灌流30min，在完全再灌注早期給予反復(fù)短暫灌流/停止灌流的后適應(yīng)，之后持續(xù)180min的灌注：②I/R組：I/R組為停止灌流30min后直接恢復(fù)再灌注180min，在停止灌流前后不做任何特殊處理；③空白對(duì)照(Sham)：持續(xù)進(jìn)行離體灌流，不加任何干預(yù)。測(cè)定梗死心肌面積，采用微型測(cè)壓球囊同步記錄心功能的變化，采用TUNEL法測(cè)定心肌細(xì)胞凋亡

6、指數(shù)(AI)、RT-PCR方法測(cè)定左室心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)，Westem blot法測(cè)定左室心肌胞漿與胞膜Bcl-2、Bax蛋白水平以及線粒體細(xì)胞色素C(Cyt.C)的釋放。 課題第三部分：96只C57BL離體小鼠建立小鼠離體心臟Langendorff灌流模型，全心缺血30min后分成如下4組，隨后再灌注3h：1)I/R組；2)IPC組；3)IPC加ERK1/2抑制劑PD98059組；4)I/R

7、加ERK1/2抑制劑PD98059組。觀察梗死心肌面積、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)與心肌磷酸化ERK1/2、磷酸化PI3K-Akt表達(dá)水平的關(guān)系，并測(cè)定心肌組織胞漿與胞膜Bcl-2、Bax蛋白以及線粒體Cyt.C的釋放。 結(jié)果：1)不同缺血時(shí)間窗的在體再灌注實(shí)驗(yàn)中，缺血30minIPC組、缺血45minIPC組心肌梗死面積分別為19.4±2.0％、38.3±4.0％，分別顯著小于缺血30min I/R組和缺血45min I/R組(分別是4

8、1.4±3.9％，55.4±5.3％)，下降幅度分別為53.1％和31.2％，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)缺血30minIPC組與缺血45minIPC組可明顯降低血清CK濃度、提高心肌組織SOD的活性、降低MDA含量以及改善血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(P<0.05)；缺血60min IPC組梗死心肌面積較60minI/R組比較無(wú)明顯降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2)心肌接受缺血30min后，3次IPC組與6次IPC組分別與I

9、/R組比較，心肌梗死面積減少，血清CK濃度降低，同時(shí)心肌SOD活性升高，心臟血流動(dòng)力學(xué)顯著改善。6次與3次后適應(yīng)循環(huán)的保護(hù)作用相似，并沒(méi)有因?yàn)樵黾宇A(yù)適應(yīng)，IPC心臟保護(hù)作用有所增加，IPC僅在恢復(fù)再灌注的早期1min內(nèi)有效。3)成功建立并改良了小鼠離體心臟Langendorff缺血后適應(yīng)模型，IPC組的心肌梗死面積[(32.8±3.8)％]較I/R組[(48.1±4.8)％]明顯降低(P<0.05)，IPC組離體心臟血流動(dòng)力學(xué)顯著改善(

10、P<0.05)；IPC組與I/R組比較，凋亡細(xì)胞顯著減少[(14.5±2.6)％vs(28.1±4.2)％，(P<0.05)]；電鏡觀察發(fā)現(xiàn)IPC可減輕缺血再灌注引起的線粒體損傷；組織Bcl-2mRNA表達(dá)顯著增加，Bcl-2和Bax mRNA的比值也隨之上調(diào)(P<0.05)；同時(shí)胞膜Bcl-2蛋白水平上升，Bcl-2/Bax蛋白的比值上調(diào)，線粒體Cyt.C釋放減少；4)與I/R組相比，IPC組心肌的ERK1/2磷酸化蛋白水平顯著增高，

11、PI3K-Akt磷酸化蛋白水平無(wú)明顯變化，心肌再灌注細(xì)胞凋亡減少(P均<0.05)。PD98059能顯著抑制IPC所引起的組織ERK1/2的磷酸化水平升高，并能消除IPC減少心肌再灌注損傷的大部分作用，同時(shí)胞膜Bcl-2蛋白水平下降以及線粒體Cyt.C釋放增多。 結(jié)論：1)小鼠心肌處于輕中度水平的缺血損傷，在恢復(fù)冠脈血流的早期施行IPC可以有效地減少心肌再灌注損傷，但隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)和心肌損傷程度的加重，IPC的保護(hù)作用就明顯

12、減弱或消失；2)IPC的心肌保護(hù)作用只有在再灌注早期的1min內(nèi)有效，延遲IPC沒(méi)有產(chǎn)生類似的保護(hù)作用，并沒(méi)有增加IPC的循環(huán)數(shù)而擴(kuò)大其的保護(hù)作用，IPC與IP沒(méi)有產(chǎn)生疊加的心臟保護(hù)作用；3)本研究建立并改良的小鼠離體心臟Langendorff缺血再灌注模型技術(shù)穩(wěn)定可靠，并證實(shí)IPC能有效地降低灌注缺血再灌注損傷，IPC能明顯減少心肌I/R損傷導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，其分子機(jī)制與上調(diào)胞膜Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)的比值以及減少線粒體Cyt.