細(xì)胞內(nèi)RT-PCR聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)白血病分子標(biāo)志和殘留白血病的研究.pdf

1、第一部分細(xì)胞內(nèi)熒光RT-PCR聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) BCR/ABL融合基因方法的建立 目的：本研究擬將FISH、PCR和FCM三種先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，建立起一種快速、敏感、特異的臨床上實(shí)用的檢測(cè)分子標(biāo)志的方法。 材料和方法：1.研究對(duì)象：陽(yáng)性細(xì)胞系(攜帶有BCR-ABL融合基因)：K562細(xì)胞系；陰性細(xì)胞系(不攜帶BCR-ABL融合基因)：NB4細(xì)胞系。 2.方法：培養(yǎng)收集K562細(xì)胞和NB4細(xì)胞，用多聚甲醛固定

2、細(xì)胞(不同濃度，不同時(shí)間，選擇最佳固定濃度及最佳固定時(shí)間)，然后用蛋白酶K對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透化處理(不同濃度，不同時(shí)間，選擇最佳濃度及最佳時(shí)間)，細(xì)胞內(nèi)反轉(zhuǎn)錄獲cDNA(優(yōu)化反轉(zhuǎn)錄條件)，用LUX熒光引物進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)PCR擴(kuò)增(優(yōu)化PCR條件)，用熒光顯微鏡和FCM分析結(jié)果。將K562細(xì)胞與正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞以1:100至1： 100000不同比例混合，同時(shí)用普通RT-PCR和細(xì)胞內(nèi)熒光RT-PCR聯(lián)合FCM分析BCR/ABL融合基因轉(zhuǎn)錄，

3、鑒定其敏感性。 結(jié)果：1.在K562細(xì)胞系，99～100％的細(xì)胞呈陽(yáng)性，表現(xiàn)出圍繞細(xì)胞核出現(xiàn)較強(qiáng)的黃綠色熒光信號(hào)。而在NB4細(xì)胞系和正常對(duì)照則無(wú)陽(yáng)性信號(hào)發(fā)現(xiàn)。 2.用細(xì)胞內(nèi)熒光RT-PCR聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BCR-ABL融和基因，當(dāng)K562細(xì)胞與正常細(xì)胞的比率小于1/104時(shí)，用流式細(xì)胞檢測(cè)不到陽(yáng)性信號(hào)。 3.普通RT-PCR:在K562細(xì)胞與正常細(xì)胞的比率小于1/104 時(shí)，BCR/ABL融合基因陰性。

4、 結(jié)論：1.LUX引物可以用于細(xì)胞內(nèi)RT-PCR。 2.細(xì)胞內(nèi)熒光RT-PCR聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)可以用來(lái)定量檢測(cè)BCR-ABL融和基因轉(zhuǎn)錄，其敏感性與普通RT-PCR相同。 第二部分用細(xì)胞內(nèi)熒光RT-PCR聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) CML患者BCR/AB L融合基因 目的：細(xì)胞內(nèi)熒光RT-PCR聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)12例CML患者的骨髓細(xì)胞BCR/ABL融合基因轉(zhuǎn)錄情況，并與RT-PCR及FISH結(jié)果相比較，來(lái)驗(yàn)證此方法

5、的敏感性、特異性及實(shí)用性。 材料和方法：1.研究對(duì)象：選擇2006-2007年間在我院治療的12例CML患者，其中 5例為初治患者， 3例為干擾素聯(lián)合羥基脲治療患者，治療時(shí)間6-16個(gè)月， 4例為伊馬替尼治療患者，治療時(shí)間為2-12個(gè)月。 2.方法：分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用4％的多聚甲醛固定細(xì)胞后，用蛋白酶K(1 ug/ml)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透化處理，用LUX引物在懸浮的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行mRNA的逆轉(zhuǎn)錄和DNA的擴(kuò)增，用熒光顯微鏡和

6、流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果。所有標(biāo)本同時(shí)用普通RT-PCR和FISH檢測(cè)BCR/ABL融合基因情況，并比較其結(jié)果。 結(jié)果：1.RT-PCR的結(jié)果：9個(gè)慢性粒細(xì)胞白血病病人，包括5個(gè)初診病人，3個(gè)用α-干擾素和羥基脲治療后的病人和1個(gè)服用伊馬替尼2個(gè)月的病人， RT-PCR.結(jié)果陽(yáng)性；而其他3個(gè)病人，正常對(duì)照和NB4細(xì)胞系，RT-PCR結(jié)果陰性。 2.I-FISH結(jié)果：對(duì)照組5份標(biāo)本BCR-ABL融合基因陽(yáng)性細(xì)胞檢出率為1.5～4.1％，

7、平均值為2.28％，標(biāo)準(zhǔn)差為0.6 1％，分界值為4.11％。初診的5個(gè)病人陽(yáng)性細(xì)胞率86～96.5％；4個(gè)治療后病人，包括3個(gè)用α-干擾素和羥基脲治療后的病人和1個(gè)服用伊馬替尼的病人，細(xì)胞陽(yáng)性率為23～80％；其他3個(gè)用伊馬替尼治療的病人和NB4細(xì)胞系為BCR-ABL融合基因陰性(陽(yáng)性細(xì)胞率＜4.11％)。 3.細(xì)胞內(nèi)RT-PCR結(jié)果：在12個(gè)CML病人中，5個(gè)初診的病人，陽(yáng)性細(xì)胞率為90～98％，3個(gè)用干擾素和羥基脲治療的病