Noggin和BDNF基因修飾的BMSCs、羥基紅花黃色素A、重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)血管性癡呆大鼠作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:①建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)的分離、培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)染技術(shù);②篩選BMSCs、Noggin和腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)基因修飾的BMSCs、羥基紅花黃色素A(hydroxysaffloryellow A，HSYA)和重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranialmagnetic s

2、timulation，rTMS)等干預(yù)血管性癡呆(vascular dementia)大鼠的方法，結(jié)合大鼠空間記憶力和海馬區(qū)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growthfactor, VEGF）的表達(dá)分析其效果;③將大鼠海馬區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-termpotentiation，LTP)與BDNF和N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-methyl-D-asparticacid receptor, NMDAR)

3、不同亞單位的表達(dá)結(jié)合，分析VaD大鼠空間記憶改善的機(jī)理。
　　 方法:①提取大鼠長(zhǎng)骨骨髓中的BMSCs，對(duì)其進(jìn)行傳代培養(yǎng)，通過(guò)MTT等方法計(jì)算細(xì)胞活力，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)、成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定;②選取第3至第5代的BMSCs進(jìn)行Noggin和BDNF基因轉(zhuǎn)染，以Westernblotting的方法檢測(cè)BMSCs目的蛋白的表達(dá);③采用2VO法制作VaD大鼠模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、PBS組、生理鹽

4、水組、BMSCs組、Noggin修飾BMSCs組、BDNF修飾BMSCs組、HSYA組和rTMS組;④對(duì)造模后1周的VaD大鼠分別給予BMSCs移植、轉(zhuǎn)染Noggin的BMSCs移植、轉(zhuǎn)染BDNF的BMSCs移植、HSYA尾靜脈注射2周和高頻rTMS4周;⑤造模后5周行水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠的空間記憶功能，行LTP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠海馬區(qū)的突觸可塑性，以Western blotting的方法檢測(cè)各組大鼠海馬區(qū)VEGF、BDNF、NR1、N

5、R2A和NR2B的表達(dá)，以HE染色觀察各組大鼠海馬區(qū)的結(jié)構(gòu)，以免疫組化的方法檢測(cè)各組大鼠海馬區(qū)VEGF和NR1的表達(dá)。
　　 結(jié)果:①通過(guò)一般形態(tài)學(xué)的觀察、流式細(xì)胞技術(shù)、成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)等鑒定方法顯示，貼壁法分離、培養(yǎng)BMSCs可以有效達(dá)到純化的目的;②通過(guò)熒光顯微鏡下觀察和Western blotting法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，顯示重組腺病毒Ad-GFP-Noggin和Ad-GFP-BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs，可使BMSCs高效表

6、達(dá)Noggin和BDNF;③HE染色結(jié)果顯示2VO法制作血管性癡呆模型，可以模擬人類血管性癡呆的病理表現(xiàn)，而各干預(yù)組均可使其病理變化得到改善;④水迷宮結(jié)果顯示BMSCs移植、Noggin和BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs移植、HSYA和rTMS均可改善 VaD大鼠的空間記憶功能，且Noggin和BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs組優(yōu)于單純給予BMSCs組;⑤Western blotting和免疫組化的結(jié)果顯示，VaD模型組大鼠海馬區(qū)VEGF表達(dá)輕度上調(diào)，HS

7、YA和BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs可以顯著上調(diào)VEGF的表達(dá)，其余各干預(yù)組增加VEGF表達(dá)的作用相對(duì)較小;⑥LTP結(jié)果顯示，各干預(yù)組均明顯優(yōu)于VaD模型組，以Noggin、BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs組和rTMS組為著;⑦Western blotting和免疫組化的結(jié)果顯示各干預(yù)組均可使海馬區(qū)BDNF、NR1和NR2B的表達(dá)上調(diào)，以BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs組和rTMS組為著，而各組對(duì)NR2A均無(wú)顯著影響。
　　 結(jié)論:①貼壁篩選法分離、培養(yǎng)大

8、鼠BMSCs，可獲得純度和活力均較高的BMSCs;②Noggin、BDNF對(duì)BMSCs的存活和分化具有重要意義，有望臨床應(yīng)用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)染BMSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病;③BDNF基因修飾的BMSCs既能修復(fù)受損的記憶功能和突觸效能，又可促進(jìn)血管生成，其總體效果優(yōu)于單純的BMSCs移植和Noggin基因修飾的BMSCs移植，對(duì)VaD有良好的治療前景;④HSYA可明顯促進(jìn)血管生成，rTMS可顯著調(diào)節(jié)突觸可塑性，有望將二者聯(lián)合用于臨床治療