京海黃雞脂肪沉積關(guān)鍵基因的篩選.pdf

1、肌肉中肌內(nèi)脂肪沉積與多種肉質(zhì)性狀相關(guān)，如嫩度、多汁性、風(fēng)味和系水力。為了迎合消費者對高肉質(zhì)不斷增加的需求，提高肌內(nèi)脂肪含量已經(jīng)成為全世界育種工作者的目標(biāo)之一。然而，在過去幾十年中，由于人們對肉雞生長速度和飼料利用率遺傳選擇的過度追求，導(dǎo)致目前雞肉質(zhì)量和風(fēng)味降低。與此同時，對肉雞生長速度的過度選擇伴隨著腹部脂肪的過度積累，因此，增加肌內(nèi)脂肪同時減少腹部脂肪沉積已經(jīng)成為目前肉雞育種工作的目標(biāo)之一。本研究一方面旨在利用RNA-seq技術(shù)描述雞

2、腹部和肌內(nèi)脂肪前體細胞在成脂分化過程中的轉(zhuǎn)錄組表達情況，鑒定兩種細胞中的lncRNAs，并分析lncRNAs的特點。一方面篩選雞腹部和肌內(nèi)脂肪前體細胞成脂分化過程中的差異表達基因，結(jié)合生物信息學(xué)方法，鑒定出可能影響雞腹部和肌內(nèi)脂肪沉積的重要因子和信號通路。最后，通過比較雞腹部和肌內(nèi)脂肪前體細胞成脂分化過程中基因的表達水平，研究雞腹部和肌內(nèi)脂肪前體細胞分化過程中轉(zhuǎn)錄組水平上的差異。主要研究結(jié)果如下:
　　1.雞腹部脂肪沉積關(guān)鍵基因的

3、篩選
　　由雞腹部脂肪組織分離培養(yǎng)獲得雞原代腹部脂肪前體細胞，誘導(dǎo)其成脂分化，油紅O染色顯示，成功分離獲得雞腹部脂肪前體細胞。在雞腹部脂肪前體細胞成脂分化過程中共鑒定出27，023條lncRNAs，分析顯示，雞腹部脂肪前體細胞中的lncRNAs具有序列和開放閱讀框短及外顯子少的特點;功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)，雞腹部脂肪前體細胞中的lncRNAs主要參與蛋白修飾、細胞蛋白修飾和信號調(diào)控等生物學(xué)過程。在雞腹部脂肪前體細胞成脂分化過程中共篩選到4，

4、232條差異表達lncRNAs和1，656條差異表達mRNAs;功能注釋顯示，差異表達基因主要富集在細胞周期、間葉細胞分化和細胞周期過程等生物學(xué)過程;通路分析結(jié)果顯示，差異表達基因顯著富集在細胞周期、DNA復(fù)制和PPAR等信號通路中。共表達分析共鑒定出了6個階段特異性模塊，并利用可視化在6個模塊中篩選出了29個高連通性的基因，這些基因可能為調(diào)控雞腹部脂肪前體細胞成脂分化的重要候選基因，包括XLOC_052948、gga-mir-30c、

5、SCD和KLF15等基因。
　　2.雞肌內(nèi)脂肪沉積關(guān)鍵基因的篩選
　　由雞胸部肌肉組織分離培養(yǎng)獲得雞原代肌內(nèi)脂肪前體細胞，誘導(dǎo)其成脂分化，油紅O染色顯示，成功分離獲得雞肌內(nèi)脂肪前體細胞。在雞肌內(nèi)脂肪前體細胞中共鑒定出26，172條lncRNAs，分析顯示，雞肌內(nèi)脂肪前體細胞中的lncRNAs具有序列和開放閱讀框短及外顯子少的特點;功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)，雞肌內(nèi)脂肪前體細胞中的lncRNAs主要參與基因表達、細胞學(xué)大分子合成、RNA代謝

6、等生物學(xué)過程。在雞肌內(nèi)脂肪前體細胞成脂分化過程中共篩選到4，694條差異表達lncRNAs和2，169條差異表達mRNAs;功能注釋顯示，差異表達基因主要富集在信號調(diào)控、細胞通信調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控等生物學(xué)過程，通路分析結(jié)果顯示，差異表達基因顯著富集在焦點黏連、MAPK及PPAR等信號通路中。共表達分析共鑒定出了6個階段特異性模塊，可視化分析在6個階段特異性模塊中篩選出了28個高連通性的基因，這些基因可能為調(diào)控雞肌內(nèi)脂肪前體細胞成脂分化的

7、重要候選基因，包括XLOC_013577、gga-mir-146b、BMP3和MYOD1等基因。
　　3.雞腹部和肌內(nèi)脂肪沉積機制比較分析
　　腹部和肌內(nèi)脂肪前體細胞間lncRNAs結(jié)構(gòu)比較分析顯示，兩種細胞lncRNAs具有相同的特點，即外顯子數(shù)少、開放閱讀框短和序列短。表達量比較顯示，兩種細胞lncRNAs的表達量均遠遠低于mRNAs。轉(zhuǎn)錄組比較分析顯示，兩種細胞間差異基因隨著分化的延長而減少，在分化第0、2、4和6天，

8、分別篩選到2，942(1，877個mRNAs和1，065個lncRNAs)、3，788(1，964個mRNAs和1，824個lncRNAs)、2，872(1，194個mRNAs和1，678個lncRNAs)和2，214(1，206個mRNAs和1，008個lncRNAs)個差異表達基因。異表達基因GO注釋顯示，在分化第0天，腹部和肌內(nèi)脂肪前體細胞之間差異表達基因主要顯著富集在生長因子應(yīng)答、生長因子刺激細胞應(yīng)答及細胞運動性調(diào)控等生物學(xué)過程

9、;在分化第2天，差異表達基因主要顯著富集在肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)育、肌肉器官發(fā)育和生長因子細胞學(xué)應(yīng)答等生物學(xué)過程中;在分化第4天，差異基因主要顯著富集在間充質(zhì)細胞分化、細胞遷移調(diào)控和細胞粘附等生物學(xué)過程中;細胞學(xué)組分分析顯;在分化第6天時，差異基因主要顯著富集在酶聯(lián)受體蛋白信號通路、運動和細胞定位等生物學(xué)過程中。Pathway分析顯示，差異表達基因顯著富集到了4條已知與脂肪前體細胞分化相關(guān)的信號通路，如PPAR和甘油酯代謝通路等。最后，我們比較了兩

10、種細胞成脂分化過程中的差異表達基因，結(jié)果顯示，兩種細胞間僅有253個共有的差異表達lncRNAs，而差異表達mRNAs則達到了911個。共有基因顯著富集到了包括細胞周期、細胞周期過程、染色體分離等在內(nèi)的超過200個生物學(xué)過程中;通路分析顯示，共有差異基因顯著富集到了包括細胞周期、細胞外基質(zhì)-受體相互作用和焦點粘連等在內(nèi)的數(shù)十條信號通路，其中包括多條已知參與脂肪生成調(diào)控的信號通路，如PPAR、p53、Foxo和TGF-beta信號通路。<

11、br>　　4.gga-mir-30c-2與XLOC_060155和SIX4基因靶關(guān)系驗證
　　高通量測序和基因共表達結(jié)果顯示，XLOC_060155、gga-mir-30c和SIX4為調(diào)控雞腹部脂肪前體細胞成脂分化的重要候選基因，XLOC_060155與gga-mir-30c及gga-mir-30c與SIX4基因的表達模式具有高度相關(guān)性。RT-qPCR結(jié)果顯示，XLOC_060155的表達模式與gga-mir-30c呈顯著負相關(guān)（

12、r=-0.97，P＜0.01），gga-mir-30c的表達模式與SIX4基因呈顯著負相關(guān)(r=-0.684，P=0.014＜0.05)。靶基因預(yù)測顯示，SIX4和XLOC_060155基因存在gga-mir-30c-5p的結(jié)合位點。雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，gga-mir-30c-5p與XLOC_060155結(jié)合后熒光素酶的表達活性顯著降低，而將結(jié)合位點突變后，熒光素酶表達活性極顯著回升;gga-mir-30c-5p與SIX43'U