Ⅱ型糖尿病大鼠心梗后非梗死區(qū)心室重構(gòu)的研究.pdf

1、研究背景：冠心病幾乎占糖尿病患者死亡率的50％,是非糖尿病患者的2～4倍，在急性心梗幸存的人群中，50％以上仍死于致命的室性心律失常，心梗后的心室重構(gòu)是導(dǎo)致室性心率失常的主要原因，試驗表明，心肌梗死(myocardialinfarction，MI)后梗死周圍區(qū)域的心肌細(xì)胞凋亡、分裂增殖、心肌肥大共同參與了心梗后心室的重構(gòu),而糖尿?。╠iabetesmellitus,DM）也對心臟細(xì)胞存在影響，本研究對糖尿病大鼠心梗后左心室梗死周邊心肌細(xì)

2、胞凋亡、分裂增殖、心肌肥大的情況進行對比分析，以探討Ⅱ型糖尿?。═ype2diabetesmellitus，T2DM）對心肌梗死后心室重構(gòu)的影響。
　　研究目的：本研究對DM大鼠心梗后左心室梗死區(qū)周邊心肌細(xì)胞的凋亡、分裂增殖及心肌肥大進行了對比分析，旨在探討T2DM對MI后心室重構(gòu)的影響。
　　研究方法：1、實驗材料雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～220g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。主要儀器有羅氏血糖儀，多導(dǎo)生理記錄

3、儀,光學(xué)顯微鏡,計算機圖像分析系統(tǒng)。主要試劑有四氧嘧啶（alloxan，ALX，Sigma公司），兔抗鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)抗體（博士德公司），小鼠抗大鼠增殖細(xì)胞核抗原（Proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）(博士德公司），即用型SABC試劑盒（博士德公司），原位細(xì)胞凋亡試劑盒（博士德公司），DAB顯色試劑盒（博士德公司）。2、DM

4、心梗模型的建立及實驗分組(1)T2DM大鼠模型的建立參照李桂榮等報道的方法制作T2DM大鼠模型，即以改良的高脂乳劑(20g煉豬油、1g丙硫氧嘧啶、10g膽固醇、1g谷氨酸鈉、5g蔗糖、5g果糖、20ml吐溫-80、30ml丙二醇加水定溶至100ml)灌胃，期間一直喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料。10d后，禁食、不禁水，過夜后稱重，按兩次給藥法腹腔注射ALX，第1次腹腔注射3％ALX溶液（臨用前在冰浴條件下用生理鹽水新鮮配制）,第2次腹腔注射2.5％ALX

5、溶液（同上），第2天再重復(fù)進行上述處理。采用羅氏血糖儀測定末次給藥后72h的空腹血糖（Fastingbloodglucose，F(xiàn)BG），F(xiàn)BG≥11.1mmol/L者，確定為T2DM模型大鼠。（2）MI大鼠模型的建立參照Himori等報道的方法，大鼠腹腔注射10g/L戊巴比妥鈉（46mg/kg），麻醉成功后，氣管插管，連接心電圖記錄儀與呼吸機。確定呼吸機工作正常后，于大鼠左側(cè)胸骨旁線處逐層開胸，暴露心臟。使用5/0絲線，于左心耳與肺動脈

6、圓錐間環(huán)繞左冠狀動脈主干標(biāo)志處穿過并結(jié)扎冠狀動脈，觀察心電圖，若出現(xiàn)ST段抬高等急性心梗表現(xiàn)，則冠狀動脈結(jié)扎成功。逐層關(guān)胸，待其自然復(fù)蘇后繼續(xù)飼養(yǎng)。對照組只于冠狀動脈處穿線，不結(jié)扎。（3）實驗動物的分組50只大鼠，存活32只。正常對照組、DM對照組（只誘發(fā)DM）、MI對照組（只誘發(fā)MI）及DM+MI組（建立T2DM大鼠MI模型）各8只，各組均繼續(xù)用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)4周后取材檢測分析。3、用免疫組化染色檢測TGF-β1和PCNA的表達。4、用

7、TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡。5、圖像分析：TGF-β1使用Image-proplus6.0軟件及專用顯微鏡對圖象進行量化分析，通過陽性蛋白在選區(qū)中的面積比表示，每張玻片在40×物鏡下進行檢測，隨即選取10個視野，計算平均值；PCNA的表達及細(xì)胞凋亡是將Olympus測微網(wǎng)格置于目鏡內(nèi)，在低倍鏡下找到病變區(qū)后，在高倍鏡(×4OO)下隨機選擇10個獨立視野，每個視野下選100個細(xì)胞，統(tǒng)計出陽性細(xì)胞的數(shù)，將10個視野中的細(xì)胞相加作為1O00

8、個心肌細(xì)胞中的陽性細(xì)胞的數(shù)，計算出陽性表達細(xì)胞的百分率。6、統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果均以±s表示。統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS15.0軟件，組間結(jié)果的比較采用方差分析，以P≤0.05者表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：1、TGF-β1的表達免疫組化染色檢測的結(jié)果顯示，DM對照組TGF-β1的表達與正常對照組比較明顯增高（P<0.01）。DM+MI組梗死區(qū)周邊TGF-β1的表達與MI對照組、DM對照組及正常對照組相比較明顯增高（P<0.0

9、1）。2、PCNA的表達與TGF-β1的表達相似，DM對照組中的表達明顯高于正常對照組，DM+MI組梗死區(qū)周邊的表達較MI對照組梗死區(qū)周邊及DM對照組、正常對照組的表達均明顯增高（P<0.01），且多為成片聚集出現(xiàn)。3、心機細(xì)胞的凋亡TUNEL法檢測結(jié)果表明，DM對照組中凋亡細(xì)胞數(shù)比正常對照組明顯增多，且多于MI對照組水平，DM+MI組梗死區(qū)周邊凋亡細(xì)胞數(shù)比MI對照組梗死區(qū)周邊及DM對照組、正常對照組均明顯增多。
　　研究結(jié)論：<

10、br>　　DM上調(diào)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（Renin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS）活性，血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）是RAAS的重要調(diào)質(zhì)，推測DM+MI組TGF-β1的表達較DM對照組和MI對照組顯著提高是由于DM心肌存在基礎(chǔ)病變，心梗后AngⅡ的正性肌力和縮血管作用加增加心肌耗養(yǎng)并減少了心肌血供，加重了心肌的缺血損害，使RAAS活性進一步增強，AngⅡ的表達與活性上