Gankyrin促進胰腺癌增殖能力的機制研究.pdf

1、【背景】
　　胰腺癌是一種惡性程度高、進展迅速和預后極差的消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤。盡管新輔助化療、外科手術(shù)技術(shù)、圍手術(shù)期護理技術(shù)已取得顯著進步，但是胰腺癌的預后并沒有明顯改善。在過去的幾十年中，科研工作者一直致力于尋找胰腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因和分子通路，對于闡明胰腺癌發(fā)病機制、改善胰腺癌患者生存與預后具有重要意義。
　　Gankyrin是在肝癌中發(fā)現(xiàn)的一個新的癌基因，定位于人類X染色體22區(qū)3帶，編碼一個包含七個錨蛋白重復序列

2、的癌蛋白，其在所有物種中均高度保守。Gankyrin蛋白在正常消化系統(tǒng)器官呈陰性或僅有微弱表達，但是在癌變組織如肝細胞癌、食管鱗狀細胞癌、結(jié)腸癌中異常高表達。Gankyrin是26S蛋白酶體的一個亞基，能與E3泛素連接酶MDM2結(jié)合，促進泛素化，負性調(diào)節(jié)P53基因；Gankyrin還可以與Rb結(jié)合，促進Rb蛋白磷酸化和降解，同時，Gankyrin還能與周期素依賴性蛋白激酶4結(jié)合，形成gankyrin-CDK4-cyclinD復合物，間接

3、活化CDK4，使Rb蛋白高度磷酸化，增強E2F轉(zhuǎn)錄子活性，促進細胞周期G1/S進展，從而促進腫瘤發(fā)生和增殖。既往研究顯示，Gankyrin的異常高表達在肝癌發(fā)生早期發(fā)揮著重要的作用，并與肝細胞細胞周期進展和暴發(fā)性肝功能衰竭中的肝再生密切相關(guān)。在食管鱗狀細胞癌，Gankyrin的高表達預示著預后不良。我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)Gankyrin的高表達與結(jié)直腸癌的惡性表型正相關(guān)。這些結(jié)果提示Gankyrin可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要相關(guān)分子

4、。但其在胰腺癌組織的分布及其作用目前未見報道。
　　【目的】
　　1.檢測Gankyrin在胰腺癌組織和胰腺癌細胞系中的表達及意義。
　　2.觀察Gankyrin對胰腺癌細胞增殖能力的影響。
　　3.探討Gankyrin影響胰腺癌細胞增殖的可能分子機制。
　　【方法】
　　1.免疫組化和Westernblot法檢測Gankyrin在胰腺癌和癌旁正常組織中的表達，并分析其臨床病理學意義。
　　2.

5、Real-timePCR和Westernblot檢測胰腺癌細胞系（SW1990、PC-2、BxPC-3和PANC-1）中Gankyrin的mRNA和蛋白的表達。
　　3.脂質(zhì)體法將Gankyrin特異siRNA載體轉(zhuǎn)染入胰腺癌SW1990細胞，將Gankyrin基因的真核表達載體轉(zhuǎn)染入PC-2細胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆。
　　4.MTT實驗、軟瓊脂集落形成實驗、流式細胞術(shù)等觀察Gankyrin對轉(zhuǎn)染細胞體外生長

6、增殖能力的影響。
　　5.裸鼠成瘤實驗檢測Gankyrin表達改變后，胰腺癌細胞的體內(nèi)成瘤能力的變化。
　　6.Westernblot檢測上述轉(zhuǎn)染細胞中細胞周期相關(guān)分子cyclinA、cyclinD1、cyclinE、CDK2、CDK4、PCNA、Rb、p-Rb、p27和p53的變化。
　　【結(jié)果】
　　1.Gankyrin在胰腺癌組織和胰腺癌細胞系中的表達。
　　Gankyrin在癌旁組織的表達陽性率為7

7、.8％(5/64)，而在胰腺癌組織的表達陽性率71.9％(46/64)，明顯高于癌旁組織（P<0.01）。在癌組織中，低分化級別組Gankyrin的表達明顯高于高分化級別組（P<0.05），TNM分期中低級別組Gankyrin的表達明顯高于高級別組（P<0.05），Gankyrin的過表達與腫瘤大小密切相關(guān)（P<0.05）。各胰腺癌細胞系（SW1990、PC-2、BxPC-3和PANC-1）均有表達Gankyrin，其中SW1990表達

8、水平最高，PC-2最低。
　　2.Gankyrin對胰腺癌細胞體內(nèi)外生長增殖能力的影響。
　　轉(zhuǎn)染Gankyrin正義載體的胰腺癌PC-2細胞較親本細胞，生長速度顯著加快，G1期進入S期的細胞比例增加，單細胞集落形成能力及裸鼠體內(nèi)成瘤能力顯著增強；而轉(zhuǎn)染Gankyrin特異siRNA的胰腺癌SW1990細胞較親本細胞，生長顯著受到抑制，G1期進入S期的細胞比例明顯降低，單細胞集落形成能力減弱，裸鼠體內(nèi)成瘤能力也顯著減弱。

9、r>　　3.Gankyrin對參與細胞周期調(diào)節(jié)的相關(guān)分子的影響。
　　轉(zhuǎn)染Gankyrin正義載體的PC-2細胞中，參與細胞周期調(diào)節(jié)的相關(guān)分子cyclinD1、cyclinE、cyclinA、CDK2、CDK4、PCNA和p-Rb表達上調(diào)，p53、p27和Rb表達受到抑制。而siRNA下調(diào)SW1990細胞Gankyrin的表達后，cyclinD1、cyclinE、cyclinA、CDK2、CDK4、PCNA和p-Rb表達亦顯著下調(diào)