Hsp60 通過提升線粒體功能促進胰腺癌發(fā)生的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　胰腺癌(Pancreatic cancer)是常見的消化道惡性腫瘤之一，常見組織類型為胰腺導管細胞癌（PDAC），據(jù)最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示2015年我國新發(fā)胰腺癌病達9萬例，居消化道惡性腫瘤發(fā)病率第五位，惡性腫瘤死因的第五位[1]。因為缺乏早期診斷，其5年生存率僅為4％，是美國第四大致死性腫瘤[2-3]。因此對于胰腺癌發(fā)生的機制研究顯得至關重要。腫瘤是一類復雜性疾病，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，腫瘤逐步獲得了包括6個生物學能力在內

2、的標志性特征及潛在兩個新發(fā)現(xiàn)的標志性特征，其中包括細胞能量代謝的重編程[4]。當然亦有研究表明線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）功能對于腫瘤進程起著重要作用,該觀點認為線粒體功能改變的逆向信號分子（如ROS,ATP等）能逆向調控核基因表達下的信號轉導通路蛋白，從而促進腫瘤的發(fā)生[5]。眾所周知，線粒體作為細胞能量代謝中心，其功能的改變必然會參與到腫瘤細胞能量代謝的重編程的過程當中，而線粒體功能的維持依賴于其自身一套獨立的質量控制系統(tǒng)[6]

3、。本課題以質量控制系統(tǒng)中一重要蛋白分子Hsp60作為研究對象，通過研究Hsp60在胰腺癌發(fā)生過程中的作用及其機制，繼而了解線粒體功能改變與胰腺癌發(fā)生的作用機制。因此本課題首先從胰腺癌組織以及各胰腺癌細胞系中發(fā)現(xiàn)Hsp60蛋白呈現(xiàn)高表達水平，隨后通過在敲低Hsp60蛋白表達的胰腺癌細胞模型中驗證線粒體功能的變化，我們發(fā)現(xiàn)低表達Hsp60后細胞線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）水平顯著降低，同時癌細胞增殖遷移能力等顯著降低。隨后我們發(fā)現(xiàn)并驗證

4、了OXPHOS水平的降低導致Erk1/2磷酸化水平的降低，而這一磷酸化的降低是由ATP生成水平降低直接導致。這一結果使得我們認為線粒體OXPHOS功能的改變逆向調控特定核基因信號轉導蛋白表達，繼而影響腫瘤的發(fā)生。這一發(fā)現(xiàn)對于明確OXPHOS水平與胰腺癌發(fā)生的確切關系顯得尤為重要，同時對于Hsp60蛋白作為一潛在胰腺癌生物學標志物提供了研究基礎。
　　目的:
　　1.為了研究線粒體OXPHOS與胰腺癌發(fā)生的關系，我們首先分析了

5、影響氧化磷酸化水平至關重要的蛋白分子Hsp60與胰腺癌的關系，從組織水平和細胞水平兩個方面對其進行評價。
　　2.為了明確Hsp60是否確實影響胰腺癌發(fā)生進程，我們分析了Hsp60蛋白敲低的胰腺癌細胞（Panc-1）其在體內、體外生物學功能的變化。
　　3.為明確Hsp60是通過何種機制影響胰腺癌的發(fā)生，我們分析了Hsp60蛋白敲低的胰腺癌細胞系(Panc-1)中OXPHOS的水平。一方面確定Hsp60表達與線粒體OXPHO

6、S水平的確切關系，另一方面探討是否通過OXPHOS水平的改變影響胰腺癌的發(fā)生。
　　4.為進一步明確 OXPHOS水平與胰腺癌發(fā)生關系，我們對正常胰腺及癌細胞的OXPHOS水平進行檢測。
　　5.為了明確由Hsp60導致的OXPHOS水平的變化是通過何種逆向調控機制影響胰腺癌的發(fā)生，我們對細胞生長增殖重要的信號轉導通路蛋白表達水平進行分析，從中發(fā)現(xiàn)差異表達信號蛋白，尋找可能致癌機制。
　　6.為明確線粒體OXPHOS水

7、平降低導致該通路蛋白表達差異，我們通過EB誘導胰腺癌細胞（Panc-1）OXPHOS缺陷模型，檢測該通路蛋白的變化。
　　7.為進一步明確OXPHOS何種逆向信號分子（ROS,ATP等）的改變逆向調控了該信號轉導通路蛋白表達，我們通過各復合體抑（Roteone,Oligomycin,FCCP）處理胰腺癌細胞（Panc-1）及其給予ATP，NAC處理Hsp60蛋白敲低的胰腺癌細胞（Panc-1），檢測該通路蛋白表達水平變化。

8、　　8.為進一步驗證差異表達信號分子是否參與胰腺癌發(fā)生機制中，我們對該信號分子在正常胰腺及癌細胞中表達水平進行檢測。
　　方法:
　　1.分別通過免疫組織化學技術和 SDS-PAGE技術檢測胰腺癌組織以及癌旁組織中Hsp60蛋白表達水平，以明確Hsp60表達水平與胰腺癌發(fā)生的關系。
　　2.通過SDS-PAGE技術檢測人源胰腺正常細胞（HPDE6c7）以及細胞胰腺癌細胞系（SW1990,Patu-8988,Panc-1

9、）中Hsp60蛋白的表達水平。
　　3.選取一株人源胰腺癌細胞（Panc-1），通過RNAi干擾技術對其Hsp60蛋白進行敲低表達。
　　4.通過 CCK-8細胞活性、細胞平板克隆、細胞劃痕實驗，Transwell小室遷移和侵襲實驗等體外實驗以及裸鼠體內成瘤實驗檢測Hsp60蛋白敲低后對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響進行分析。
　　5.通過BN-PAGE技術、氧耗能力（OCR）檢測技術、ATP生成檢測技術、ROS

10、生成對Hsp60蛋白敲低的Panc-1細胞OXPHOS水平進行檢測。
　　6.通過BN-PAGE技術和氧耗能力（OCR）檢測技術對人源胰腺正常細胞（HPDE6c7）以及胰腺癌細胞系（SW1990,Patu-8988,Panc-1）的超級復合體表達情況和氧耗能力進行檢測。
　　7.通過SDS-PAGE技術對細胞生長增殖重要的信號通路蛋白（P38,JNK,Erk1/2, AMPK,AKT等）在Hsp60蛋白敲低的Panc-1細胞

11、中表達水平進行分析
　　8.通過給予EB藥物不同時間的處理，利用SDS-PAGE檢測上述差異信號通路蛋白表達水平。
　　9.通過SDS-PAGE技術，利用Roteone,Oligomycin,FCCP藥物處理Panc-1細胞以及給予ATP和NAC處理Hsp60蛋白敲低的Panc-1細胞，檢測上述差異信號通路蛋白表達水平。
　　10.通過SDS-PAGE技術，檢測各人源胰腺正常細胞（HPDE6c7）以及細胞胰腺癌細胞系（

12、SW1990,Patu-8988,Panc-1）中上述差異信號通路蛋白表達水平。
　　11.統(tǒng)計學分析：應用SPSS19.0軟件分析細胞之間復合體表達量和線粒體功能的差異。
　　結果:
　　1.通過免疫組織化學技術和SDS-PAGE檢測胰腺癌組織以及癌旁組織Hsp60蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)Hsp60蛋白表達在胰腺癌組織中呈高表達水平，具有顯著性差異。
　　2.查閱文獻，確定本課題所用人源胰腺正常及癌細胞(HPDE6c

13、7,SW1990,Patu-8988,Panc-1）
　　3.通過 SDS-PAGE技術檢測到在胰腺癌細胞系中 Hsp60蛋白表達水平呈高表達水平
　　4.選取其中一株胰腺癌細胞Panc-1作為后續(xù)驗證實驗的細胞模型，將其Hsp60蛋白敲低后，發(fā)現(xiàn)癌細胞在體外生長增殖能力、遷移和侵襲能力均顯著下降，在體內成瘤能力減弱。
　　5.通過BN/SDS-PAGE技術、氧耗能力檢測、ATP及ROS生成實驗對其OXPHOS水平進行

14、檢測，發(fā)現(xiàn)超級復合體表達水平下降，OCR值下降，ATP生成能力下降，ROS生成增高。
　　6.通過 BN/SDS-PAGE技術和氧耗能力檢測正常胰腺細胞和癌細胞的OXPHOS水平，發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細胞系中超級復合體表達量以及OCR值均較正常胰腺細胞高，具有顯著性差異。
　　7.我們對一系列信號分子（P38,JNK,Erk1/2,AMPKa,AKT等）進行檢測，結果表明Panc-1細胞Hsp60蛋白敲低后，其Erk1/2磷酸化水平

15、降低，而其他信號分子卻并未明顯改變。
　　8.在給予EB藥物處理Panc-1細胞后，隨著處理時間延長，Erk1/2磷酸化水平逐步降低。
　　9.給予Rotenone，Oligomycin藥物處理Panc-1細胞后，其Erk1/2磷酸化水平降低，而FCCP處理后磷酸化水平未發(fā)生明顯改變，同時給予Oligomycin和FCCP處理后其磷酸化水平也下降。
　　10.給予ATP處理Hsp60蛋白敲低的Panc-1細胞后，其Er

16、k1/2磷酸化增高，然而NAC處理卻未發(fā)生明顯變化。
　　11.通過SDS-PAGE檢測HPDE6c7,SW1990,Patu-8988,Panc-1細胞中Erk1/2磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)在癌細胞系中，Erk1/2磷酸化水平增高。
　　結論:
　　1.由免疫組織化學技術和SDS-PAGE在胰腺癌組織中檢測Hsp60蛋白高表達水平表明 Hsp60蛋白參與胰腺癌發(fā)生的進程當中，而在各人源胰腺癌細胞系中Hsp60高表達水平則進一

17、步表明該結論。
　　2.將Hsp60蛋白敲低后Panc-1細胞，其細胞生長增殖能力、遷移和侵襲能力均下降，癌細胞生物學特性降低，說明Hsp60對促進胰腺癌發(fā)生具有直接關系。
　　3.在Hsp60蛋白敲低的Panc-1細胞中，其超級復合體表達水平下降，OCR值下降，ATP生成能力下降，ROS生成增高，說明Hsp60蛋白對于維持線粒體OXPHOS功能起著重要作用。
　　4.根據(jù) BN/SDS-PAGE技術和氧耗能力檢測到

18、HPDE6c7，SW1990，Patu-8988， Panc-1細胞中癌細胞系的超級復合體表達量以及 OCR值均較正常胰腺細胞高，表明胰腺癌細胞較高的線粒體OXPHOS水平促進了胰腺癌的發(fā)生。
　　5.通過對生長增殖信號通路蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)，在Hsp60蛋白敲低的Panc-1細胞中，Erk1/2磷酸化水平下降，同時在給予不同時間EB處理Panc-1細胞后， Erk1/2磷酸化水平也發(fā)生下降，該結果表明線粒體 OXPHOS水平的下降或

19、缺陷介導Erk1/2磷酸化水平下降導致癌細胞生物學特性降低。與此同時在癌細胞系中Erk1/2磷酸化水平升高也驗證了這一結論。
　　6.在給予Rotene，Oligomycin藥物處理Panc-1細胞后，其Erk1/2磷酸化水平降低，而FCCP處理后磷酸化水平未發(fā)生明顯改變，同時給予Oligomycin和FCCP處理后其磷酸化水平也下降。該結果說明由OXPHOS水平降低引起Erk1/2磷酸化降低是由于ATP生成降低所導致，而給予AT