拉米夫定耐藥的慢乙肝患者救援治療過程中YMDD變異的演化及其對治療療效的影響.pdf

1、研究背景:
　　 抗病毒治療是慢性乙型病毒性肝炎(chronichepatitisB，CHB)治療的關(guān)鍵。拉米夫定(LAM，lamivudine)是第一個被批準(zhǔn)用于慢乙肝抗病毒治療的藥物，它能有效的抑制乙肝病毒的復(fù)制。從而顯著的降低血清中HBVDNA(hepatitisBvirusDNA)的水平，促進HBeAg(hepatitisBeantigen)的血清學(xué)轉(zhuǎn)換，改善肝臟的炎癥活動，延緩或阻止肝臟疾病的進展，降低肝癌(HCC，H

2、epatocellularcarcinoma)的發(fā)生率。由于其相對較低的價格，拉米夫定仍然是很多病人進行抗病毒治療的首選藥物，特別是在發(fā)展中國家。但是長期治療過程中產(chǎn)生耐藥是抗病毒治療的一個難題。拉米夫定治療一年的基因耐藥率是14-32％，治療2年、3年和4年后分別上升到38％、49％和66％。有些病人在出現(xiàn)病毒學(xué)突破后發(fā)生肝炎的急性惡化，導(dǎo)致肝臟失代償，甚至是死亡。耐藥后繼續(xù)拉米夫定的治療將不能獲得臨床益處。所以及時進行救援治療是至關(guān)

3、重要的。
　　 阿德福韋(ADV，adefovir)是核苷類似物抗病毒藥物的一種，無論體內(nèi)研究還是體外研究都證實:阿德福韋除了能有效抑制HBV野生株復(fù)制外，對拉米夫定耐藥的YMDD(tyrosine-methionine-aspartate-aspartate)變異株的復(fù)制也有較強的抑制作用，而且對變異株復(fù)制的抑制作用可能優(yōu)于野生株。由于以上的特性，阿德福韋被廣泛應(yīng)用于拉米夫定耐藥患者的救援治療。聚乙二醇干擾素α-2α（派羅欣，

4、Pegasys）是一種長效干擾素，其半衰期長，給藥方便，優(yōu)于傳統(tǒng)干擾素。歐洲肝病指南建議聚乙二醇干擾素作為慢乙肝（不論E抗原陰性還是陽性）的一線用藥，雖然聚乙二醇干擾素α-2a作為萬能治療方法仍然有一些未解決的疑問，但有研究顯示聚乙二醇干擾素α-2a可能為拉米夫定耐藥的患者提供了一種新的抗病毒治療的選擇。
　　 阿德福韋和聚乙二醇干擾素α-2a均可用做為拉米夫定耐藥的救援治療。但不論是哪種方法，其治療療效均不理想，總的來說表現(xiàn)為

5、HBVDNA下降緩慢、耐藥率升高、停藥后快速反彈等。只有一小部分患者對救援治療有良好的應(yīng)答反應(yīng)。對于應(yīng)答不佳的這部分患者，不少研究曾從病毒學(xué)方面探索其應(yīng)答不佳的原因。有研究報道拉米夫定耐藥的慢乙肝患者在阿德福韋單藥救援治療過程中，大部分YMDD變異株在治療48周內(nèi)逆轉(zhuǎn)為野生株。也有研究表明拉米夫定耐藥突變的演化可能是影響救援治療療效的一個重要因素。但目前還沒有系統(tǒng)的研究來闡明拉米夫定耐藥突變的逆轉(zhuǎn)在臨床抗病毒治療中的意義。而且，拉米夫定

6、耐藥患者在聚乙二醇干擾素治療過程中YMDD變異的演化尚無報道。
　　 所以我們的研究目的是探討YMDD變異的逆轉(zhuǎn)對救援治療療效的影響;并觀測在干擾素治療過程中YMDD變異是否也會發(fā)生快速逆轉(zhuǎn)。
　　 研究目的:
　　 1.研究阿德福韋單藥治療或聚乙二醇干擾素治療過程中YMDD變異的演化;
　　 2.探討影響YMDD變異逆轉(zhuǎn)的因素;
　　 3.探討YMDD變異的逆轉(zhuǎn)對救援治療療效的影響。
　　

7、 研究方法:
　　 1.樣本來源
　　 樣本來自一項隨機對照臨床試驗(www.controlled-trials.com，ISRCTN79659320)。該臨床試驗的設(shè)計如下:入組的患者均經(jīng)過INNO-LiPA耐藥檢測，證實為YMDD變異的拉米夫定耐藥患者。所有患者均為HBeAg陽性，以2:1的比例隨機分配到A（聚乙二醇干擾素α-2a組）、B（阿德福韋組）兩組。A組患者給予聚乙二醇干擾素α-2a180μg/次/周治療4

8、8周，停藥后繼續(xù)隨防24周;B組患者給予阿德福韋10mg/次/天治療72周;所有患者在前12周均聯(lián)合使用拉米夫定100mg/次/天的治療。由于部分患者血清樣本不足或缺失，本實驗最終納入了124例患者。其中聚乙二醇干擾素α-2a組45例，阿德福韋組79例。
　　 2.HBVDNA抽提
　　 取基線、12周、24周、48周、72周等時間點的系列血清，使用DNA抽提試劑盒(QIAampDNABloodMiniKit)嚴(yán)格按照說

9、明從血清（每個血清樣本使用量為200μl）中提取HBVDNA以備下一步實驗使用。
　　 3.HBV聚合酶基因的擴增和測序
　　 巢式PCR（Sugauchietal）擴增HBVRT區(qū)，使用第二輪PCR純化產(chǎn)物進行直接測序(InvitrogenLtd.ShangHaiChina)。
　　 4.測序結(jié)果的分析
　　 從Gen-Bank中下載所有基因型的HBVDNA全序作為參考序列，使用CLUSTAL-W的方法

10、將測序的結(jié)果與A-G基因型的參考序列進行同源性比對。用HBVS基因做進化樹來進行基因分型。所有序列的比對均使用MEGA5.0軟件分析包進行，序列峰圖檢驗采用Chromas軟件進行，RtM204V/I變異的判斷采用Mutationsurveyor3.0軟件識讀并進行人工確認(rèn)。
　　 5.統(tǒng)計分析
　　 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件(version17.0，SPSSInc.，Chicago，IL)進行分析，率的比較

11、用x2檢驗或者Fisher確切概率檢驗分析。定量資料用兩獨立樣本的t檢驗進行分析。累積YMDD變異逆轉(zhuǎn)率計算采用Kaplan-Meier法，累計YMDD變異逆轉(zhuǎn)率的比較采用log-rank(Mantel-Cox)檢驗進行分析。所有結(jié)果均采用雙側(cè)檢驗，P＜0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.救援治療過程中YMDD變異的演化
　　 1.1救援治療過程中YMDD變異的逆轉(zhuǎn)率
　　 YMD

12、D變異的逆轉(zhuǎn)定義為在某個時間點，用直接測序法檢測到病毒準(zhǔn)種以HBV野生株為優(yōu)勢株。如果檢測到野生株和變異株混合感染，則按照優(yōu)勢株的結(jié)果進行分析。聚乙二醇干擾素α-2a組患者12、24、48和72周的YMDD變異逆轉(zhuǎn)率分別為:7％(3/45)、53％(24/45)、73％(33/45)、91％(41/45)。阿德福韋組患者12、24、48和72周的YMDD變異逆轉(zhuǎn)率分別為:6％(5/79)、38％(30/79)、52％(41/79)、57

13、％(45/79)。
　　 1.2YMDD變異的逆轉(zhuǎn)和adefovir耐藥突變的發(fā)生
　　 在救援治療過程中，阿德福韋組患者有4例發(fā)生了A181T/V耐藥突變，其中3例為A181T變異，1例為A181V變異，救援治療1年的耐藥發(fā)生率大概為5.1％。值得注意的是4例A181T/V耐藥變異均發(fā)生在YMDD變異逆轉(zhuǎn)后。
　　 1.3YMDD變異與補償變異的同步逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象
　　 救援治療過程中，rtL80V/I、rt

14、L180M等補償變異位點會隨著YMDD變異株的逆轉(zhuǎn)而消失。提示補償變異與YMDD變異存在于同一條序列上。
　　 2.基線期影響YMDD變異演化的因素
　　 2.1rtL80V/I對YMDD變異逆轉(zhuǎn)的影響
　　 按照基線期rt80位點的補償變異情況將所有患者分為兩組:rt80L組（66例）和rt80V/I組（58例）。12周、24周、48周和72周rt80L組的累積YMDD變異逆轉(zhuǎn)發(fā)生率為6.1％(4/66)、45

15、.5％(30/66)、65.2％(43/66)、75.8％(50/66);rt80V/I組的累積逆轉(zhuǎn)發(fā)生率分別為6.9％(4/58)、41.4％(24/58)、53.4％(31/58)、62.1％(36/58)。兩組比較無顯著性差異(x2=0.694，P=0.405)。
　　 2.2rtL180M對YMDD變異逆轉(zhuǎn)的影響
　　 按照基線期rt180位點的補償變異情況將所有患者分為兩組:rt180L組(40例)和rt180

16、M組（84例）。12周、24周、48周和72周rt180L組的累積YMDD變異逆轉(zhuǎn)發(fā)生率為7.5％(3/40)、50.0％(20/40)、67.5％(27/40)、75.0％(30/40);rt180M組的累積逆轉(zhuǎn)發(fā)生率分別為6.0％(5/84)、40.5％(34/84)、60.0％(47/84)、66.7％(56/84)。兩組比較無顯著性差異(x2=3.098，P=0.078)。
　　 2.3治療方法對YMDD變異逆轉(zhuǎn)的影響<

17、br>　　 聚乙二醇干擾素α-2a組(45例)在12周、24周、48周和72周的累積YMDD逆轉(zhuǎn)率分別為7％(3/45)、53％(24/45)、73％(33/45)和91％(41/45);阿德福韋組（79例）分別為6％(5/79)、38％(30/79)、52％(41/79)和57％(45/79)。兩組比較有顯著性差異(x2=3.876，P=0.049)。
　　 2.4不同的YMDD變異(YIDD、YVDD)對逆轉(zhuǎn)的影響

18、　　 測序結(jié)果顯示46例為YVDD變異，60例為YIDD變異，其余17例為YV/IDD混合變異。為了分析不同YMDD類型逆轉(zhuǎn)率的差異，將這17例按照測序峰圖主峰處理，其中7例以YVDD為主，按照YVDD處理;10例以YIDD為主，按照YIDD處理。最終YVDD共53例，YIDD共71例。YVDD組（53例）在12周、24周、48周和72周的累積YMDD逆轉(zhuǎn)率分別為7.5％(4/53)、50.9％(27/53)、71.7％(38/53)

19、、79.2％(42/53)，YIDD組（71例）分別為5.6％(4/71)、38.0％(27/71)、50.7％(36/71)、62.0％(44/71)。兩組比較無顯著性差異(x2=2.509，P=0.113)。
　　 2.5常見補償變異(rtL80V/I、rtL180M)的數(shù)目對YMDD變異逆轉(zhuǎn)的影響
　　 按照基線期補償變異位點個數(shù)將所有病例分為三組:A組13例:無補償變異位點，B組81例:有一個補償變異位點，C組3

20、0例:有2個補償變異位點。A組(13例)在12周、24周、48周和72周的累積YMDD逆轉(zhuǎn)率分別為15.4％(2/13)、38.5％(5/13)、61.5％(8/13)、69.2％(9/13);B組（81例）分別為3.7％(3/81)、49.4％(40/81)、66.7％(54/81)、76.5％(62/81);C組（30例）分別為10.0％(3/30)、30.0％(9/30)、40.0％(12/30)、50.0％(15/30)。三組比

21、較有顯著性差異（x2=4.214，P=0.04）。
　　 2.6不同基因型對YMDD變異逆轉(zhuǎn)的影響
　　 本研究患者均為B基因型和C基因型，其中B基因型32例，C基因型92例。B基因型患者（32例）12周、24周、48周和72周的累積YMDD逆轉(zhuǎn)率分別為9.4％(3/32)、56.3％(18/32)、75.0％(24/32)、84.3％(27/32);C基因型患者(92例)分別為5.4％(5/92)、39.1％(36/9

22、2)、54.3％(50/92)、64.1％(59/92)。兩組比較有顯著性差異(x2=5.194，P=0.023)。
　　 2.7基線HBVDNA水平對YMDD變異逆轉(zhuǎn)的影響
　　 根據(jù)基線HBVDNA水平將患者分為三組:A組39例:HBVDNA＜7.0log10IU/mL;B組54例:7.0log10IU/mL≤HBVDNA＜8.0log10IU/mL;C組31例:HBVDNA≥8.0log10IU/mL。A組(39例

23、)在12周、24周、48周和72周的累積YMDD逆轉(zhuǎn)率分別為7.7％(3/39)、48.7％(19/39)、66.7％(26/39)、74.4％(29/39);B組（54例）分別為9.3％(5/54)、44.4％(24/54)、57.4％(31/54)、68.5％(37/54);C組（31例）分別為0.0％(0/31)、35.5％(11/31)、54.8％(17/31)、64.5％(20/31)。三組比較有顯著性差異(x2=6.295，

24、P=0.043)。
　　 2.8YIDD與YVDD在選擇補償變異位點上的差異
　　 71例YIDD變異的患者有70％(50/71)伴有rtL80V/I變異，而53例YVDD變異的患者有15％(8/53)伴有rtL80V/I變異，兩組比較具有顯著性差異(x2=37.314，P＜0.001)。71例YIDD變異的患者有44％(31/71)伴有rtL180M變異，而53例YVDD變異的患者100％(53/53)伴有rtL180

25、M變異，兩組比較具有顯著性差異(x2=40.078,P＜0.001)。
　　 3.YMDD變異的逆轉(zhuǎn)對病毒學(xué)和生化學(xué)應(yīng)答的影響
　　 為了分析逆轉(zhuǎn)對應(yīng)答的影響，將患者分為早期逆轉(zhuǎn)組和非早期逆轉(zhuǎn)組。早期逆轉(zhuǎn)定義為:在救援治療24周內(nèi)患者體內(nèi)的HBV準(zhǔn)種從以YMDD變異株為主逆轉(zhuǎn)為以野生株為主。而在24周內(nèi)尚未發(fā)生逆轉(zhuǎn)的患者歸為非早期逆轉(zhuǎn)組。最終，124例患者有110例可以納入到此項分析，其中70例為阿德福韋治療的患者，40

26、例是聚乙二醇干擾素α-2a治療的患者。剩余14例由于24周PCR陰性而不能納入分析。
　　 3.1.阿德福韋治療組YMDD變異的逆轉(zhuǎn)對病毒學(xué)和生化學(xué)應(yīng)答的影響
　　 基于上述定義，阿德福韋治療的患者有30例為早期逆轉(zhuǎn)組，40例為非早期逆轉(zhuǎn)組。兩組患者在性別、年齡、基因型、YMDD變異類型、補償變異個數(shù)和基線期HBVDNA及ALT水平上均無顯著性差異。治療結(jié)束時早期逆轉(zhuǎn)組和非早期逆轉(zhuǎn)組患者HBVDNA下降水平有顯著性差異（

27、t=-3.255，P=0.002）。非早期逆轉(zhuǎn)組的ALT復(fù)常率高于早期逆轉(zhuǎn)組，雖然在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著性差異(x2=3.717，P=0.054)。另外，非早期逆轉(zhuǎn)組治療結(jié)束HBVDNA檢測不到率顯著高于早期逆轉(zhuǎn)組（x2=4.057，P=0.044）。
　　 3.2.聚乙二醇干擾素α-2a組YMDD變異的逆轉(zhuǎn)對病毒學(xué)和生化學(xué)應(yīng)答的影響
　　 基于上述定義，聚乙二醇干擾素α-2a治療的患者有24例為早期逆轉(zhuǎn)組，16例為非早期逆

28、轉(zhuǎn)組。兩組患者在性別、年齡、基因型、YMDD變異類型、補償變異個數(shù)和基線期HBVDNA及ALT水平上均無顯著性差異。治療結(jié)束時早期逆轉(zhuǎn)組和非早期逆轉(zhuǎn)組患者HBVDNA下降水平有顯著性差異(t=-0.883,P=0.383)。兩組患者的ALT復(fù)常率無顯著性差異（x2=1.778，P=0.182）。兩組患者的HBVDNA檢測不到率亦無顯著性差異(x2=0.462，P=0.681)。
　　 結(jié)論:
　　 1.在阿德福韋治療48

29、周內(nèi)，大部分拉米夫定耐藥患者會發(fā)生YMDD變異株向野生株的逆轉(zhuǎn);在聚乙二醇干擾素α-2a治療過程中也有同樣的現(xiàn)象，證明干擾素與阿德福韋一樣對拉米夫定耐藥的HBV變異株亦無選擇壓力。
　　 2.與初治患者相比，拉米夫定耐藥的患者阿德福韋治療一年的耐藥率明顯升高，而且阿德福韋耐藥突變都發(fā)生在YMDD變異逆轉(zhuǎn)之后。
　　 3.補償變異和YMDD變異在同一病毒株上，隨著YMDD變異的逆轉(zhuǎn)補償變異也會發(fā)生逆轉(zhuǎn)。
　　 4.

30、影響YMDD變異逆轉(zhuǎn)的因素有救援治療方法、補償變異的個數(shù)、基因型和基線期HBVDNA水平?？偟脕碚f，聚乙二醇干擾素α-2a治療的患者YMDD逆轉(zhuǎn)率更高;合并的補償變異個數(shù)越多YMDD變異越不容易逆轉(zhuǎn)，故補償變異可以延緩YMDD變異的逆轉(zhuǎn);C基因型的患者YMDD變異不易逆轉(zhuǎn);基線期HBVDNA水平較高的患者YMDD變異不易逆轉(zhuǎn)。
　　 5.YMDD逆轉(zhuǎn)對病毒學(xué)和生化學(xué)應(yīng)答的影響取決于救援治療方法的不同。阿德福韋治療過程中，YMDD

31、的早期逆轉(zhuǎn)不利于應(yīng)答，提示發(fā)生早期逆轉(zhuǎn)的患者要及時更改救援治療方案。而在聚乙二醇干擾素α-2a治療過程中，逆轉(zhuǎn)對應(yīng)答似乎沒有明顯的影響。另外，本研究結(jié)果提示聚乙二醇干擾素α-2a不適合用于拉米夫定耐藥的救援治療。
　　 6.YIDD和YVDD在補償變異的選擇上有明顯差異。YVDD變異的病毒株均合并有rtL180M變異，少部分也合并有rtL80V/I變異;而YIDD變異的病毒株常合并rtL80V/I變異，少部分合并rtL180M變