反義抑制鯊烯合酶基因表達(dá)對(duì)產(chǎn)紫穗槐烯酵母工程菌生物合成的影響.pdf

1、青蒿素是目前治療瘧疾的首選藥物，但天然來源受到多種因素制約，通過基因工程方法生產(chǎn)其中間體青蒿酸、進(jìn)而化學(xué)半合成青蒿素是解決資源問題的重要途徑之一。為構(gòu)建青蒿酸高產(chǎn)酵母工程株系，本論文開展了紫穗槐-4，11-二烯(簡(jiǎn)稱：紫穗槐烯，AD)的生物合成途徑工程研究并取得如下進(jìn)展： 1.ADS整合型釀酒酵母工程菌的構(gòu)建：根據(jù)同源雙交換的原理，構(gòu)建可以在釀酒酵母的λDNA序列處進(jìn)行雙交換的紫穗槐-4，11-二烯合酶(ADS)基因(ADS)的

2、整合載體。λDNA序列在釀酒酵母基因組中大約有200個(gè)拷貝，把外源基因整合在這個(gè)位點(diǎn)可以大大提高外源基因在釀酒酵母中表達(dá)的拷貝數(shù)。構(gòu)建ADS整合載體首先要把釀酒酵母的強(qiáng)啟動(dòng)子ADH和終止子連在載體上，然后把ADS基因亞克隆到強(qiáng)啟動(dòng)子ADH和終止子之間，再連接一個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記基因URA3，還要把λDNA序列分成兩個(gè)交換臂連在所有待整合基因的兩端。用這個(gè)構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型釀酒酵母，篩選出ADS整合型工程菌。得到的菌株經(jīng)過發(fā)酵培

3、養(yǎng)后，用GC-MS檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)過計(jì)算，其中一株工程菌產(chǎn)紫穗槐烯的量達(dá)到117.0mg·L-1。 2.ADS整合型工程菌和ADS附加體型工程菌AD產(chǎn)率比較：將本論文構(gòu)建的ADS整合型工程菌和實(shí)驗(yàn)室以前構(gòu)建的ADS附加體型工程菌各選3株，同時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)，然后進(jìn)行發(fā)酵液提取和GC-MS檢測(cè)。結(jié)果顯示，整合型工程菌的AD產(chǎn)率明顯高于附加體型工程菌的AD產(chǎn)率(P＜0.01)。 3.鯊烯合酶基因(SQS)反義RNA表達(dá)載體的構(gòu)建：

4、設(shè)計(jì)反義RNA時(shí)，人們普遍應(yīng)用由翻譯起始位點(diǎn)向上下游延伸0.5kb-3.0kb的片段作為重組質(zhì)粒的逆向插入序列，5’和3’非翻譯區(qū)(UTR)往往具有良好的效果。本研究把SOSmRNA的4個(gè)基因片段：SQS1(5’-UTR)，SQS7(3’-UTR)，SQS3﹡4.(5’UTR加5’編碼區(qū))以及SQS5﹡6(3’-編碼區(qū)加3'-UTR)分別反向插入到pYeDP60的GAL10/CYC1半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建成4個(gè)相應(yīng)的SOS反義R

5、NA表達(dá)載體pYeD/SQS1、pYeD/SQS7、pYeD/SQS3﹡4、pYeD/SQS5*6。 4.SQS反義RNA表達(dá)對(duì)AD釀酒酵母工程菌生物合成的影響：用上述4個(gè)SQS反義RNA表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化ADS整合型酵母工程菌，得到含有SQS反義RNA的ADS酵母工程菌。用GC-MS檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中的AD和鯊烯(SQ)的量，初步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入SQS反義表達(dá)載體后，鯊烯(SQ)和AD的產(chǎn)率比轉(zhuǎn)入前均有所下降?？赡艿脑蚴牵核治龅闹?/p>

6、組菌樣本量比較少，而這些重組菌中轉(zhuǎn)入的反義基因片段除了引起SQS表達(dá)下調(diào)以外，還引起ADS表達(dá)的部分抑制。 本論文還開展了重組SARS未知功能小蛋白的大腸桿菌表達(dá)、純化及抗體制備研究： 5.SARS-CoV未知功能小蛋白的表達(dá)、純化、鑒定及抗體制備：在大腸桿菌BL21trxB(DE3)中，表達(dá)了重組SARS-CoV未知功能小蛋白X4、X5和ORF10。對(duì)X5和ORF10重組蛋白進(jìn)行了Ni+親和層析純化。ORF10純化時(shí)，

7、用低濃度咪唑(60mM·L-1)梯度洗脫，獲得22KD和44KD兩個(gè)蛋白條帶；在用高濃度咪唑(120mM·L-1)梯度洗脫時(shí)，只有分子量大小為22KD的蛋白條帶。制備這兩種條帶并送中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定，結(jié)果顯示：在22KD和44KD兩種蛋白樣品中均能檢測(cè)到與ORF10蛋白序列100％同源的若干個(gè)片段，兩種樣品所測(cè)得的片段分別占總ORF10蛋白序列理論值的38.3％和45.1％，由此推測(cè)：所獲得的重組蛋白就是O

8、RF10蛋白，其中44KD的蛋白條帶可能是該蛋白的二聚體的形式，這也很可能是病毒進(jìn)入人體后起作用的形式。 在純化X5蛋白時(shí)，用和ORF10一樣的純化方法卻沒有得到X5蛋白，推測(cè)X5蛋白是以包涵體形式存在。用尿素變性溶解包涵體，然后所得上清用親和柱層析，Tris緩沖液復(fù)性的辦法得到了高產(chǎn)率、高純度的蛋白。用復(fù)性后的蛋白免疫兔子得到了高效價(jià)的X5蛋白的抗血清。Western免疫印跡顯示尿素變性純化再?gòu)?fù)性的X5蛋白的抗體能夠和菌體中表