黃花蒿紫穗槐二烯合酶T296位點突變對其功能的影響.pdf

1、萜類化合物是自然界天然次生代謝產(chǎn)物的重要組分之一。截至目前，人們已經(jīng)從各種生物中分離鑒定了70，000多種萜類化合物，這種數(shù)量和結(jié)構(gòu)的多樣性得益于萜類合酶及環(huán)化酶的催化多樣性。隨著大量有價值的萜類不斷被發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)了萜類合酶結(jié)構(gòu)和功能的研究，在理論方面加深了對萜類合酶的作用機理的理解，了解結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，在應(yīng)用中指導(dǎo)了酶的理性設(shè)計和新藥物的開發(fā)。萜類化合物研究中的核心問題之一是生物體產(chǎn)生出數(shù)量眾多的結(jié)構(gòu)多樣化的萜類化合物的機制探究，很大

2、程度上依賴于萜類環(huán)化酶催化特異性的機制研究。實驗室研究團(tuán)隊以黃花蒿的紫穗槐二烯合酶(ADS)為模型，以多種倍半萜合酶，環(huán)化酶為研究對象，結(jié)合生物信息學(xué)和分子生物學(xué)手段，利用點突變和中間產(chǎn)物飼喂法探索酶的結(jié)構(gòu)和催化路徑等問題。
　　本文圍繞T296V突變的顯著效應(yīng)展開進(jìn)一步研究。對T296位點的突變發(fā)現(xiàn)當(dāng)該點突變成V以后改變了主產(chǎn)物，同樣催化底物FPP（法尼基焦磷酸）原紫穗槐二烯（環(huán)化）產(chǎn)量大幅下降，而線性非環(huán)化的法尼烯成了新的主產(chǎn)

3、物。推測并實驗證實這一轉(zhuǎn)變是酶關(guān)鍵位置的殘基體積改變造成的，具體來說，該氨基酸處在疏水口袋“門口”位置，和疏水口袋的封口有關(guān)系，突變造成了封口的不完整和底物結(jié)合取向的變化。將RNPP（R構(gòu)型橙花叔基焦磷酸）作為底物時，T296V突變的催化主產(chǎn)物又恢復(fù)90％原主產(chǎn)物紫穗槐二烯，這意味著RNPP作為底物彌補了296位點突變?yōu)閂對ADS的影響。而從催化路徑的角度來講，證明了T296V催化FPP生成紫穗槐二烯受阻的位點。其二，針對V的突變效應(yīng)的