人鯊烯合成酶的克隆表達及其重組工程菌的高密度發(fā)酵研究.pdf

1、高膽固醇血癥(hypercholesterolaemia)是動脈粥樣硬化(atherosclerosis)和冠心病(coronary heart disease，CHD)發(fā)生發(fā)展的主要因素之一。1984年首次證明血漿中膽固醇水平與CHD的危險性有關(guān)。抑制膽固醇的生物合成是降低血漿膽固醇水平的重要手段。 他汀類藥物(HMG-CoA還原酶抑制劑)是目前應(yīng)用最廣泛的降膽固醇藥物，可有效地降低心血管疾病的發(fā)病率及死亡率。盡管他汀類藥物

2、在臨床應(yīng)用中顯示了良好的安全性，但是由于HMG-CoA還原酶處于甲羥戊酸途徑的上游位置，他汀類藥物不僅抑制了膽固醇的合成，同時也是抑制了其他非甾體類異戊二烯物質(zhì)(如長萜醇、泛醌、異戊烯基tRNA和異戊二烯基蛋白質(zhì)等)的合成，因此選擇性抑制膽固醇生物合成也成為了未來降膽固醇藥物開發(fā)的一個理想方向。鯊烯合成酶(squalene synthase，farnesyl-diphosphate farnesyltransferase，SQS，EC2

3、.5.1.21)處于膽固醇合成支路，抑制該酶可以有效地降低血清膽固醇的水平，而不會影響其他非甾體類異戊二烯的合成，因此SQS也成為近年來降膽固醇藥物非常具有潛力的靶點。 本文利用RT-PCR技術(shù)成功克隆了HepG2細胞SQS基因(FDFT1)CDS的核心片段(tFDFT1)，通過測序證實，克隆序列編碼的氨基酸片段與報道的SQS的相應(yīng)區(qū)域(tSQS)相同，繼而將該片段構(gòu)建劍原核表達載體pET28a(+)上在E.coli BL21

4、(DE3)中融合表達，并用Ni2+-Sepharose親和柱對蛋白進行純化。根據(jù)NADPH的消耗在鯊烯合成酶催化反應(yīng)中與鯊烯的形成成化學(xué)計量關(guān)系這一特點，在340/380nm處雙波長測定NADPH吸收值減少，間接測定重組tSQS的活性。另外，為了大量制備重組tSQS，在3L發(fā)酵罐中進行了重組菌的高密度發(fā)酵，比較了發(fā)酵培養(yǎng)基成份、誘導(dǎo)時間、不同碳源等因素對菌體生長及重組tSQS表達量的影響。結(jié)果顯示重組FDFT1基因的陽性克隆獲得成功，分