重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)類人膠原蛋白Ⅱ發(fā)酵過程優(yōu)化.pdf

1、為了實現(xiàn)類人膠原蛋白Ⅱ(Human-Like Collagen Ⅱ，簡稱HCLⅡ)的規(guī)?；a(chǎn)，提高類人膠原蛋白Ⅱ的產(chǎn)量，本研究主要從發(fā)酵過程中pH、溫度培養(yǎng)模式以及發(fā)酵過程補料流加策略三方面對對重組大腸桿菌BL213.7在30L發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)類人膠原蛋白Ⅱ過程進行了考察。
　　 在對發(fā)酵過程pH的優(yōu)化中，將pH控制在6.0-7.8之間時，監(jiān)測pH對細胞生長以及類人膠原蛋白Ⅱ的產(chǎn)量的影響，從而確定出合理的pH控制策略增加類人膠

2、原蛋白Ⅱ的產(chǎn)量。由實驗數(shù)據(jù)可得，在pH7.5條件下細胞濃度達到最大，為68.5g/L，但類人膠原蛋白Ⅱ的濃度為8.5g/L。在pH6.8條件下，類人膠原蛋白Ⅱ濃度達到最大，為10.5g/L，但其細胞濃度只有60.9g/L。同時，對發(fā)酵過程中代謝副產(chǎn)物有機酸的含量也進行了監(jiān)測。隨著發(fā)酵過程pH值的升高，總有機酸的量也相應(yīng)的增加，當發(fā)酵過程pH控制在7.8時，總有機酸濃度達到最大，為15.61g/L。為了提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量以及提高底物的利用

3、率，采用pH兩階段控制策略控制發(fā)酵，最終類人膠原蛋白Ⅱ濃度可達到11.3g/L，較恒pH條件下提高了7.61％。
　　 在對發(fā)酵過程溫度培養(yǎng)模式的選擇方面，采用三階段的溫度培養(yǎng)模式，在誘導前3h，分別升溫至36℃、37℃、38℃培養(yǎng)至誘導期，考察其對細胞生長以及類人膠原蛋白Ⅱ表達的影響。實驗結(jié)果表明，36℃和38℃溫度培養(yǎng)模式下所得產(chǎn)量相對較低。所以發(fā)酵過程采用發(fā)酵前期34℃進行培養(yǎng)，誘導前3h升溫至37℃培養(yǎng)，最后升溫誘導，在

4、37℃溫度培養(yǎng)模式下獲得了較高的細胞密度，為69.4g/L；且類人膠原蛋白Ⅱ的表達量最高，為11.93g/L。相較于前期研究的基礎(chǔ)上，細胞密度與類人膠原蛋白Ⅱ的表達量分別提高了4.9％和5.5％。
　　 在對整個發(fā)酵過程進行優(yōu)化的過程中，考察了誘導前后不同補料流加方式對整個發(fā)酵過程的影響。結(jié)果表明，誘導前控制比生長速率0.15h-1有利于細胞的生長，細胞密度為73.4g/L，同時類人膠原蛋白Ⅱ的表達量為12.43g/L。當發(fā)酵過

5、程進入誘導期后，分別采用pH-stat、指數(shù)型、不同速率的間歇型以及階段遞減型補料流加策略對發(fā)酵過程進行控制，同時對發(fā)酵過程的不同參數(shù)進行檢測，根據(jù)不同補料流加策略分析其對整個發(fā)酵過程的影響。結(jié)果表明，誘導后根據(jù)前期實驗結(jié)果所設(shè)計出來的階段遞減的方式進行補料，有利于菌體的生長，細胞密度達到78.2g/L；同時類人膠原蛋白Ⅱ的表達量也最高，為13.28g/L。在前期研究的基礎(chǔ)之上，產(chǎn)量提高了11.31％。因此，整個發(fā)酵過程的補料調(diào)控策略對