絨毛膜癌轉(zhuǎn)移基因的篩選及沉默相關(guān)基因?qū)ζ淝忠u力影響的研究.pdf

1、第一章高低侵襲力絨毛膜癌細胞株差異表達基因的篩選和鑒定 目的：采用基因芯片技術(shù)比較高、低侵襲力絨毛膜癌細胞株JEG-3和JAR的基因表達譜，以篩選出與絨毛膜癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，為闡明絨毛膜癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制提供理論依據(jù)。 方法：（1）應(yīng)用MTT和Matrigel體外侵襲試驗檢測不同人絨毛膜癌細胞系JEG-3與JAR之間增殖能力和侵襲能力的差異：（2）提取絨毛膜癌細胞株JEG-3和JAR的總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備雜交探針，

2、運用基因芯片進行雜交，雜交信號用AgilentScanner掃描，用Imagene軟件和Genespring軟件分析和處理數(shù)據(jù)；（3）應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測小窩蛋白-1（CAV-1）和血管內(nèi)皮細胞生長因子B（VEGF-B）在JEG-3和JAR絨毛膜癌細胞株中的表達情況，進而驗證基因芯片結(jié)果的可信度。 結(jié)果：（1）JEG-3和JAR細胞之間增殖能力的差異無顯著性（P>0.05），但JEG-3細胞的侵襲能力顯著高于JAR細胞（P<

3、0.05）；（2）對絨毛膜癌JEG-3和JAR細胞株的基因表達譜分析，發(fā)現(xiàn)兩者表達差異顯著的基因有742個，其中在JEG-3細胞中321個基因表達上調(diào)，422個基因表達下調(diào)，上調(diào)基因中與細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)的基因有51個，其中差異最顯著的前五位分別是纖維連接蛋白（FN）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、尿激酶型纖溶酶原激活因子（uPA）、小窩蛋白-1（CAV-1）和血管內(nèi)皮細胞生長因子B（VEGF-B）；（3）CAV-1和VEGF-B

4、mRNA在JEG-3細胞中的表達水平顯著高于在JAR細胞中的表達水平，結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致。 結(jié)論（1）多個侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達在絨毛膜癌JEG-3和JAR細胞間存在著差異：（2）基因芯片技術(shù)能有效地分析各細胞系的基因表達譜、為研究絨毛膜癌轉(zhuǎn)移機制提供新的途徑。 第二章靶向Caveolin-1shRNA載體的構(gòu)建和沉默效應(yīng)觀察 目的：設(shè)計合成針對Caveolin-1基因的shRNA質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染人絨毛膜癌高侵

5、襲力細胞JEG-3，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制JEG-3細胞中Caveolin-1基因，建立可用于研究Caveolin-1基因功能的JEG-3細胞模型。研究Caveolin-1shRNA轉(zhuǎn)染對人絨毛膜癌高侵襲力細胞株JEG-3中Caveolin-1表達及其對JEG-3細胞在體內(nèi)、外浸潤和轉(zhuǎn)移能力的影響。旨在進一步明確Caveolin-1在人絨毛膜癌進展過程中的作用及機制，探討將Caveolin-1作為靶分子，運用shRNA技術(shù)對人絨毛膜癌進

6、行基因治療的可行性。 方法：（1）構(gòu)建靶向抑制Caveolin-1基因表達的短發(fā)夾雙鏈RNA（shRNA）真核表達載體pshRNA-Caveolin-1；（2）采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將載體導(dǎo)入人絨毛膜癌高侵襲力細胞JEG-3中，利用G-418對轉(zhuǎn)染細胞JEG-3進行穩(wěn)定表達克隆篩選，獲得穩(wěn)定持續(xù)表達shRNA的JEG-3細胞；（3）用RT-PCR和WesternBlot方法分別從mRNA和蛋白水平觀察RNA干擾對Caveolin-1表

7、達的抑制效應(yīng)：（4）應(yīng)用Matrigel體外侵襲試驗檢測Caveolin-1shRNA對絨毛膜癌細胞的體外侵襲能力的影響；（5）建立裸鼠皮下異種移植模型，觀察Caveolin-1shRNA對絨毛膜癌細胞的體內(nèi)侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響。 結(jié)果：（1）成功構(gòu)建靶向抑制Caveolin-1基因的shRNA載體，并經(jīng)測序證實：（2）建立可用于研究Caveolin-1基因功能的JEG-3細胞模型：（3）發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pshRNA-Caveolin-

8、1的JEG-3細胞中Caveolin-1mRNA及蛋白質(zhì)的表達比空白組和陰性對照組JEG-3細胞中Caveolin-1mRNA及蛋白質(zhì)的表達均明顯下降，差異具有顯著性（P<0.05）：（4）通過Matrigel體外侵襲試驗證明抑制Caveolin-1基因在JEG-3細胞中的表達可降低JEG-3細胞的體外侵襲能力（P<0.05）；（5）在對裸鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，抑制Caveolin-1基因在JEG-3細胞中的表達可使裸鼠皮下腫瘤的大小降低（

9、P<0.05），腫瘤細胞肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率降低（P<0.05）。 結(jié)論：（1）細胞內(nèi)表達shRNA可長期敲低靶基因的表達，可建立較理想的基因功能研究細胞模型。（2）Caveolin-1基因與人絨毛膜癌侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能是一種新的腫瘤治療靶分子。（3）RNA干擾有望為人絨毛膜癌基因治療提供新策略。 第三章靶向VEGF-BshRNA載體的構(gòu)建和沉默效應(yīng)觀察 目的：研究VEGF-BshRNA轉(zhuǎn)染對人絨毛膜癌高侵襲力細胞株

10、JEG-3中VEGF-B表達及JEG-3細胞體內(nèi)外侵襲、轉(zhuǎn)移、促進血管生成能力的影響。旨在進一步明確VEGF-B在人絨毛膜癌進展過程中所起的作用及機制，探討將VEGF-B作為靶分子，運用shRNA技術(shù)對人絨毛膜癌基因治療的可行性。 方法：（1）構(gòu)建靶向抑制VEGF-B基因表達的短發(fā)夾雙鏈RNA（shRNA）真核表達載體pshRNA-VEGF-B；（2）采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將載體導(dǎo)入人絨毛膜癌高侵襲力細胞JEG-3中，利用G-418對

11、轉(zhuǎn)染細胞JEG-3進行穩(wěn)定表達克隆篩選，獲得穩(wěn)定持續(xù)表達shRNA的JEG-3細胞；（3）用RT-PCR和WesternBlot方法分別從mRNA和蛋白水平觀察RNA干擾對VEGF-B表達的抑制效應(yīng)；（4）應(yīng)用Matrigel體外侵襲試驗檢測VEGF-BshRNA對絨毛膜癌細胞的體外侵襲能力的影響；（5）建立裸鼠皮下異種移植模型，觀察VEGF-BshRNA對JEG-3細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響：（6）采用免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測移植瘤組織中V

12、EGF-B的表達情況以及CD34標記的MVD表達情況。 結(jié)果：（1）成功構(gòu)建靶向抑制VEGF-B基因的shRNA載體，并經(jīng)測序證實；（2）建立可用于研究VEGF-B基因功能的JEG-3細胞模型：（3）發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF-B的JEG-3細胞中VEGF-BmRNA及蛋白質(zhì)的表達比空白組和陰性對照組JEG-3細胞中VEGF-BmRNA及蛋白質(zhì)的表達均明顯下降，差異具有顯著性（P<0.05）：（4）通過Matrigel體外侵

13、襲試驗證明抑制VEGF-B基因在JEG-3細胞中的表達可降低JEG-3細胞的體外侵襲能力（P<0.05）；（5）在對裸鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，抑制VEGF-B基因在JEG-3細胞中的表達可使裸鼠皮下腫瘤的大小降低（P<0.05），腫瘤細胞肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率亦有降低（P<0.05）：（6）VEGF-B在空白組和陰性對照組移植瘤中的表達較轉(zhuǎn)染組高（P<0.05），MVD在空白組和陰性對照組移植瘤中高表達，在轉(zhuǎn)染組移植瘤中表達降低（P<0.05）；（7